必威体育精装版抗体酶在生物催化领域的应用.ppt

LICME LICME 抗体酶在生物催化领域的应用邓茹生研4班 抗体酶 制备 应用 问题及展望 实例 作用原理 简介 一.抗体酶简介 抗体结构 定义 抗体酶是生物体受抗原诱导产生的具有催化能力的抗体, 其在结构上与抗原高度互补并能与之特异结合，其本质就是一类具有催化能力的免疫球蛋白,但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又被称为“催化性抗体”。 结构 抗体酶主要来自IgG 抗体分子。对抗体结构分析表明: IgG 分子是由2条相同的重链及2条相同的轻链靠二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用抗体后，产生3个片断，其中相同的2个片断为Fab ； Fab 中与抗原结合的部位，是高度可变区( Fv ) ，该部位广泛的结构及顺序变化决定了抗体对外来物质的识别特性，其中电荷互补及立体互补是其分子识别的主要特征。 二.抗体酶的作用原理 抗体酶是生物体受抗原诱导产生的具有催化能力的抗体, 其在结构上与抗原高度互补并能与之特异结合。通过设计化学反应过渡态或中间体类似物作为半抗原, 诱导机体产生抗体, 产生的抗体能特异性地识别过渡态分子, 降低反应的活化能, 达到催化反应的目的。抗体酶和所有的抗体一样, 都是由两条轻链和两条重链构成, 抗原与轻链和重链的可变区特异性结合, 因此可变区的氨基酸的排列顺序决定了抗体分子的特异性, 其本质是一类具有催化活性的免疫球蛋白, 可变区赋予其酶的属性, 所以也称为催化抗体。 抗体酶可催化趋向性反应及非趋向性反应, 后者可能分为两种情况:一是在放热分解反应中控制反应构象, 使多产物反应转变为单产物生成为主的反应;另一种情况是降低反应中过渡态能障。但抗体酶缺少天然酶的韧性或扭曲性, 没有天然酶所具有的底物去稳作用, 而可能只起稳定过渡态的作用。 抗体酶能催化酯水解反应，Oxy-Cope重排反应等多种反应，而在抗体催化的反应中，研究最广泛的是酯水解反应，所以在这里只介绍一下酯水解反应的原理。酯水解反应的过渡态是带负电荷的四面体结构。以MOPCI67催化碳酸脂水解为例说明。首先通过化学合成过渡态磷酸脂的类似物-硝基苯磷酰胆碱脂，利用过渡态类似物作为半抗原，并将其与牛血清蛋白偶合，制成抗原注入动物体内，动物体的血液中就会产生可以和过渡态碳酸脂特异性结合的抗体MOPCl67，然后采用单克隆技术分离纯化出MOPCI67。在抗体催化碳酸脂反应中，MOPCI67和过渡态碳酸脂结合后，提高了反应物过渡态的稳定性，降低了反应的活化能，从而加速了水解反应的进程。 三.抗体酶的制备 通过免疫动物产生血清多克隆抗体 细胞工程阶段，即用杂交瘤技术生产单克隆抗体 利用基因工程途径表达和改造抗体 第一阶段 第二阶段 第三阶段 诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原免疫小鼠, 制作单克隆抗体, 筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。因半抗原没有免疫原性, 需要将设计好的半抗原分子与载体蛋白(如白蛋白)偶联制成完全抗原, 然后免疫动物, 按单克隆抗体制备程序获得杂交瘤, 分泌单克隆抗体, 经筛选和纯化得特异性的抗体酶。 制备方法:(1)过渡态类似物的构建:由于准确的过渡状态很难确定或合成, 因此, 制备抗体酶使用的半抗原是过渡态类似物, 这一步是关键。(2)抗原的制备:将人工设计并构建的过渡态类似物(半抗原), 用化学方法与载体蛋白相连成完全抗原, 然后免疫动物。(3)利用单克隆抗体筛选技术制备抗体酶, 这种杂交瘤细胞能够产生单一的抗体, 又能在细胞培养条件下快速繁殖,可以大量制备单一抗体。 （1）诱导法 提取脾细胞培养 过渡态类似物免疫小鼠 提取骨髓细胞培养 细胞融合培养 ELISA效价检测筛选 杂交瘤细胞亚克隆 亚类鉴定 冻存细胞株 制备腹水并纯化 制备流程 （2）拷贝法 拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的, （如图）。首先, 用已知的酶作为抗原免疫动物, 通过单克隆技术, 得到抗酶抗体。然后,再将此抗体作为抗原去免疫动物, 再次采用单克隆技术, 经筛选和纯化就可获得具有原来酶活性的抗体酶。因为抗原与该抗原产生的抗体具有互补性, 经两次拷贝, 就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上了, 使该抗体酶活性中心的空间结构与原酶的形状完全一致, 保证了对同底物的特异性。 将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，一般可采用两种方法: 即选择性化学修饰法和基因工程定点突变法。 （3） 抗体结合部位修饰法 A.化学修饰法 抗体酶可以用化学惨饰的方法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种吻合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基团或辅助基团，如果引人的催化基团与底物结合部位取向正确空间排布恰到好处，就能产生高活力的抗体酶。为提高抗体酶的催化能力，可采用邻近效应，静电催化，应变，功能团催化等方法，在抗体结合位