经典液相色谱法要点.ppt

Chap. 5 经典液相色谱法 本章内容层次 掌握：吸附色谱法、分配色谱法的基本原理以及应用，薄层色谱法的基本操作。 熟悉：离子交换色谱法的基本原理以及应用。 了解：尺寸排阻色谱法、聚酰胺色谱法的基本原理以及应用。 §1 吸附色谱法 1. 基本原理 1.1 定义 一种溶质基于吸附现象而获得分离的液－固色谱分析方法，按操作方式又可分为吸附柱色谱和薄层色谱。 1.2 吸附色谱法的依据 吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 解附的动态平衡,存在一个吸附平衡常数 K=Cs/Cm 2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异 吸附机理 流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之，溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。 1.3 吸附等温线 指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，组分在固定相中的浓度Cs对组分在流动相中的浓度Cm作图得到的曲线，用函数描述为Cs=f（Cm），它描述了组分在两相中浓度之间的关系。 2. 吸附剂 2.1 对吸附剂的要求 1）颗粒要有一定的细度且粒度要均匀 2）具有较大的吸附表面积和一定的吸附能力 3）与洗脱剂、样品不起化学反应，且不溶于洗脱剂中 2.2 常用吸附剂 无机类：氧化铝、硅胶、硫酸钙、滑石粉、硅藻土等。 有机类：活性炭、淀粉、蔗糖等。 其中以硅胶和氧化铝较为常用。 1）氧化铝 优点：分离能力强、活性可控 分类：酸性、中性、碱性 以中性氧化铝使用较多,用来分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不稳定的苷类、醌、内酯等化合物。 活化温度：200～400℃ 2）硅胶 优点：适用于各类样品的分离 吸附能力：取决于骨架表面的硅醇基 吸附机理：硅胶表面羟基作为质子给予体，通过氢键形式将溶质吸附在硅胶表面。 由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类和其它碱性化合物。 活化温度：105～110℃ 2.3 吸附剂的活性 吸附剂的活性与含水量有一定的关系。 吸附剂在使用前必须先经过活化处理。 活化：在一定温度下，加热除去水分以增强活性的过程。 3. 色谱条件的选择 在吸附色谱中，除了正确选择吸附剂外，还可以通过流动相的选择来改变K值，或改变一对化合物的K值比，从而使它们的K值有最大的差别而达到分离。流动相在色谱分析中除了起着溶质通过色谱柱的作用，还影响着溶质的分配系数，所以在色谱分析中流动相的选择也很重要。极性较大的化合物可以比较强的从溶液中被吸附剂吸附，需要极性较大的洗脱剂才能洗脱下来。 4. 操作方法—薄层色谱 4.1 基本概念 1）薄层色谱法 将吸附剂（或载体）均匀地铺在玻璃板或塑料板、铝箔、聚酯薄膜上，形成薄层，把要分离的样品点加在薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。 2）比移值Rf 在薄层色谱法中，常用比移值Rf来表示各组分在色谱中的保留行为。 Rf(A)= b/c Rf(B)=a/c 在给定条件下，Rf值为常数，其值在0～1之间。 当Rf值为0时，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移动，仍在原点位置；Rf为1时，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶剂同步移动。 Rf值：一般要求0.2～ 0.8 最佳范围0.3～0.5。 3）薄层色谱法的特点 展开时间短，一般只需十几到几十分钟； 分离能力强，斑点集中； 灵敏度高，通常用量为几至几十微克； 显色方便； 仪器简单，操作方便。 4.2 操作技术 薄层色谱法的操作步骤： 选择—制板—点样—展开—斑点的检出—定性定量 1）选 择 (1)选板 —玻璃板表面光滑、平整清洁 (2)固定相：吸附剂；粘合剂 (3)流动相 (4)显色剂 2）制板 薄层板的制备，就是将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板上，使成薄层称之为制板。 制板的步骤： (1)吸附剂的涂布 (2)板的活化 (1) 吸附剂的涂布 常用薄板：加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板 一般氧化铝采用软板多，而硅胶常采用硬板。 硬板的涂铺方法：倾注法 、平铺法、涂铺器 、喷雾法 (2) 板的活化 铺成的薄层，必需置于水平台面上晾干（也可以热风吹干），再置烘箱中活化即可。 3）点样 薄层分析时，一般使用微量注射器或毛细管点样。 注意事项： （1）溶剂应易挥发或用流动相。 （2）样品浓度合适，一般对照品浓度宜控制在几mg/ml。 4）展开 （1）展开原理 将薄板一端浸入展开剂，点样处不可接触展开剂，展开剂借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。