蛋白的分离纯化详解精要.ppt

分离纯化流程 预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换） 原理（问度娘） Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 3. 双向电泳（概念、原理、作用、用途） 将等电聚焦技术与SDS技术组合起来的新技术，是目前分离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。 基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS。 双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 应用 凝胶中蛋白的检测 图像采集和分析 蛋白鉴定 分离蛋白质组所有蛋白 （1） IEF等电聚焦电泳 （2）SDS（3）染色脱色 pH 3 - - - - - 10 图像分析 在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。 蛋白质的浓缩 超滤法 冷冻干燥法 沉淀法 三、蛋白质的鉴定1. 蛋白质的含量测定2. 蛋白质分子量的测定3. 蛋白质免疫印迹技术 蛋白质的含量测定 目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量； 最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法， Lowry Folin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。 3. 蛋白质分子量的测定SDS测定分子量凝胶过滤层析法测定分子量质谱法 1. SDS测定分子量 基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4g SDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。 2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。 2. 凝胶过滤层析法测定分子量 蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg Mr＝K1－K2 Ve 在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。 SDS与凝胶过滤法是互补的 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量； SDS测得的是蛋白质亚基的分子量； 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。 质谱法是最精确的分子量测定方法 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。测定蛋白质分子量的精确度为0.01～0.1％。 4. 蛋白质免疫印迹技术 ( 重点 必须掌握） 印迹法的基本原理 印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。 目前常用的印迹法： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 重点 蛋白质印迹的用途 用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。 Western blotting原理图示 * 一、蛋白质的分离纯化概述 与蛋白质分离纯化相关的理化特性 分子大小 分子形状 带电特性 溶解特性 与配体特异性结合不同 吸附性质 变性和复性 哪些技术、原理 分子大小 重点 大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。 常用方法 透析 超滤 凝胶过滤 离心 分子形状 重点 形状：蛋白质在离心通过溶液、膜、凝胶颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。 方法 密度梯度离心 电泳 分子筛层析（三格写，两格不写） 电荷 原理：蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。 方法 电泳 离子交换层析 溶解度 原理：由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。 方法： 盐析法 有机