蛋白质的提取与分离分离精要.ppt

中英联合实验室 第三章 蛋白质的提取与分离 剧烈的蛋白裂解方法 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。 常用方法： （1）超声波裂解法：细胞样品 （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径 而产生剪切力(shearing force )，从而裂解 细胞；常用于含有细胞壁的微生物、藻类 （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于 液氮中，随后研磨成粉末 （4）机械匀浆法： （5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破 细胞壁；用于细胞悬液或微生物 蛋白沉淀方法 影响二维电泳图谱的杂质 样品制备的分类 可溶性样品制备 组织样品制备 固体组织样品常在裂解液中破碎，最好的方法是将组织在液氮中冷冻破碎。 组织样品存在样品异质性问题，通常采用基于免疫亲和技术的正、负性选择，以富集特殊的细胞群，裂解后可直接应用。 目前，微量切割技术可以用来从组织样品中获取纯的细胞群，其中最受关注的是激光捕获微量切割技术（LCM）。 亚细胞器分离与蛋白质提取 亚细胞器的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋白。 依据密度差异进行细胞分级。 一般方法：低速离心分离出细胞核和未破碎细胞，得到上清夜。然后梯度离心分离各种细胞器。 3.2 蛋白质分离技术 目前常用的分离技术 1）凝胶电泳技术 1D Gel Electrophoresis 2D Gel Electrophoresis Capillary Electrophoresis 2）色谱技术 2D-HPLC 二维凝胶电泳 二维凝胶电泳又称双向凝胶电泳（two－dimensional gel electrophoresis，2-DE）,是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。 基 本 原 理： 第一相是根据不同蛋白质所带电荷量的特性，利用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF ) 蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点 第一相等电聚焦电泳系统内含有高浓度的脲和非 离子型去垢剂NP-40或兼性离子去污剂CHAPS，而且溶解蛋白质样品的溶液除含有脲和NP-40(CHAPS)外，还含有二硫苏糖醇—其作用使蛋白质分子内部的二硫键破坏，达到充分变性 这些试剂不带有电荷，不会影响蛋白质的原有电 荷和等电点。 Isoelectric Focusing Ampholytes vs. IPG 第一相等电聚焦电泳结束后带有蛋白质的凝胶从玻璃管中脱出后（可置于零下80度保存），必须经过第二相SDS电泳分离系统的溶液平衡。所用平衡液为含有疏基乙醇和SDS的第二相浓缩胶缓冲液。 巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质的充分结合。 一般振荡平衡30分钟，使等电聚焦凝胶中的两性电解质和高浓度的脲扩散出胶，使等电聚焦凝胶为第二相浓缩胶缓冲液所平衡。 第二相是根据不同蛋白质分子量大小的特性，通过蛋白质与SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的不同分子大小迁移达到分离蛋白质的目的(SDS)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。 SDS是一种阴离子去垢剂，和蛋白质的疏水部位结合，它能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可以引起以下的反应： ① 蛋白质本身的电荷变化被屏蔽 ② 氢键被断裂 ③ 疏水相互作用被取消 ④ 形成椭球形。 在强还原剂巯基乙醇（or dithiothreitol (DTT)）存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键已被还原打开不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质—SDS复合物。 实验证明，当SDS单体浓度大于1mmol/L对于多数蛋白质来说，平均每克蛋白质可结合1.4g SDS。蛋白质分子与SDS结合的复合物，所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有带电量，掩盖了不同种类蛋白质分子之间原有电荷差异。 蛋白质—SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它在水溶液中的形状类似于长椭圆棒(prolate bar)，不同蛋白质—SDS复合物，其椭圆棒的短轴长度是恒定的，约为18 A；长轴的长度与蛋白质的分子量大小成比例地变化 蛋白质—SDS复合物在SDS—聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率(mobility ratio)便不再是蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于椭