蛋白质的通性纯化和表征精要.ppt

蛋白质的通性、纯化和表征 短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。 等电聚焦电泳：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将蛋白质点样，只要该处的PH与蛋白质的PI不同，则蛋白质就会带电，PH值PI时，蛋白质带-电；PH值PI时，蛋白质带+电。通电后，蛋白质就会移动，直到某处的PH＝PI，蛋白质才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。 （1）蛋白质的分子大小在1 ~100nm之间，属于胶体质点的范围，在动力学上是稳定的； （2）水化层：蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等） ，具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集； （3）同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有相同的净电荷，相互排斥，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。(precipitation)。 1、盐析法 ? 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 ? 调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加加速蛋白质沉淀。 ? 常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。 ? 当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。 ? 重金属沉淀的蛋白质通常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 ? 若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。 ? pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。 ? 血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 ? 将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。 ? 加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 在层析柱中装入葡聚糖凝胶颗粒。这种凝胶颗粒具有多孔的网状结构。这些网孔只允许较小的分子进入颗粒内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的相对分子质量大的分子先被洗脱下来，相对分子质量小的分子后下来。 （二）填充题 1、蛋白质分子中氮的平均含量为_______，故样品中的蛋白质含量常以所测氮量乘以_______即是。 2、除半胱氨酸和胱氨酸外，含硫的氨基酸还有_________，除苏氨酸和酪氨酸外，含羟基的氨基酸还有__________，在蛋白质中常见的20种氨基酸中，__________是一种亚氨基酸，___________不含不对称碳原子。 3、蛋白质的氨基酸残基是由_________键连接成链状结构的，其氨基酸残基的______称蛋白质的一级结构。 4、β-折叠片结构的维持主要依靠两条肽键之间的肽键形成________来维持。 5、在螺旋中C=O和N—H之间形成的氢键与_______基本平行，每圈螺旋包含_____个氨基酸残基，高度为_______，每个氨基酸残基使螺旋轴上升______，并沿轴旋转______度。 6、用凝胶过滤法分离蛋白质，相对分子质量较小的蛋白质在柱中滞留的时间较_______，因此最先流出凝胶柱的蛋白质，其相对分子质量最_______。 7、稳定蛋白质胶体溶液的因素是________和________。 8、免疫球蛋白G（IgG）含有________条重链，_______条轻链，通过________键联接成Y形结构，每一分子含有_______个抗原结合部位。 9、一般说来，球状蛋白质在其分子内部含有________性氨基酸残基，而在分子外表面含________性氨基酸残基。 10、胰蛋白酶专一性地切断________和________的羧基端肽键。 （三）选择题（在备选答案中选出1个或多个正确答案） 1.下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收？ A. 色氨酸的吲哚环 B. 酪氨酸的酚环 C. 苯丙氨酸的苯环 D. 半胱氨酸的硫原子 E. 肽键 2.关于氨基酸的叙述哪一项是错误的？ A. 酪氨