蛋白质的稳定性和稳定化精要.ppt

添加剂 专一性底物及配体; 非专一性中性盐和多羟基物质; 与失活剂竞争的物质或除掉破坏化学催化剂的物质 添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗PH变化，抗变性剂，抗稀释作用 例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，并助于形成“溶剂层”，增加表面张力和溶液黏度，这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用 蛋白质非共价相连 蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定 酶形成的多聚体或聚合体的活力和稳定性也常比其单体高 三、化学修饰 化学修饰即修饰作用可达到稳定酶的作用，得到可溶性稳定化酶。 1.可溶性大分子修饰酶：聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白蛋白，多聚氨基酸 2. 小分子修饰酶 原因： 修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象； 修饰关键功能基团也会达到稳定化； 由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基团有可能形成附加氢键或盐键； 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用； 蛋白质表面基团的亲水性； 交联酶晶体 酶的失活和再活化 对于可逆性酶，可以采取相应措施实现其再活化 例如：用过量的碘离子使脲酶重新天然化，该酶失活是由于重金属阳离子使巯基中毒引起，再活化的机理是碘离子与结合的金属离子形成碘结合物 对于不可逆变性酶，可用下述方法进行再活化：用变性剂使固定化酶伸展成无规则盘绕状态 必威体育精装版进展 可将变性的蛋白质分子孤立在反胶束内，蛋白质在反相胶束内可重新折叠成天然状态，而且没有与其他变性分子接触和聚合，此胶束由表面活性剂稳定的水滴构成，并悬浮于异丁烷中。 第四节 各种酶稳定化方法的比较 比较各种不同的酶稳定化方法是困难的，因此制定的了一下一般的标准： ①稳定性至少要增加1~3个数量级 ②应对各种酶失活因素(物理，化学及生物学因素) ③稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性 ④稳定化方法适合各类蛋白质 ⑤稳定化方法应在体内，体外都适用 ⑥从经济角度看，方法应具有方法的潜力 蛋白质工程定义 以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。 第五节 蛋白质工程 蛋白质工程的基本目标： 是按预期的结构和功能，通过分子设计和DNA 重组技术，对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专一性和稳定性。 改变蛋白质稳定性的蛋白质工程方法 ①DNA改组技术 ②定点突变技术 ③组合设计 ④理性设计 DNA改组技术的定义 DNA 改组( DNA shuffling ), 也称分子育种(molecular breeding)或有性PCR( sexual PCR) , 是以单个基因或多个同源基因(一般为天然存在的基因家族)为模板, 将其切割成一系列随机大小的DNA小片段, 然后在体外通过聚合酶链式反应( polymerasechain reaction, PCR)将这些片段随机重组成全长基因, 实现同源基因重组, 达到分子进化目的的一种技术。 随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结构与功能研究的突破，特别是PCR 技术的进一步成熟，DNA 改组技术(DNA shuffling)更加成熟，使得DNA 改组成为蛋白质体外分子进化的主流技术。 DNA 改组技术具有许多重要优点， 例如不需要事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变体的方法。 第四章 蛋白质的稳定性和稳定化 第一节: 蛋白质的稳定性 一. 蛋白质稳定性的分子原因 蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力。 维持蛋白质结构稳定的主要因素: 1.金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用 金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其他低相对分子质量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。