蛋白质的性质分类及研究方法精要.ppt

离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 离子交换层析分离氨基酸的原理 离子交换反应是可逆的，当提高洗脱液的pH和离子强度时，降低了氨基酸与阳离子交换树脂之间的亲和力，所以各种氨基酸就以不同的顺序被洗脱下来。 使用强酸型阳离子交换树脂分离氨基酸混合物时，酸性和极性较大的氨基酸先被洗脱下来，接着是中性氨基酸，最后洗脱下来的是碱性氨基酸。 5、亲和层析 原理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。 亲和层析过程 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠（或胶粒） 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了 6、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析 （四）电泳 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带电荷的正负性和多少不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。 自由界面电泳: 蛋白质溶于缓冲液中进行电泳 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸有缓冲液的支持物上进行电泳, 不同组分形成带状区域 － ＋ 已渐被乙酸纤维素薄膜电泳取代 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙 烯酰胺）作支持物 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 圆盘电泳：在玻璃管中进行的凝胶电泳 平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳 等电聚焦电泳( IEF )：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － －   双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的 等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量 的不同用SDS（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰 胺能叫电泳）分离，把复杂蛋白混合物中 的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面 改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心 方法 双向凝胶电泳： IEF与SDS组合 （五）HPLC（高效液相色谱） 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 End -AA-AA-Lys -AA-AA-Arg -AA-AA-Pro -AA-AA-pro-AA 羧肽酶A不能作用 -AA-AA-Lys -AA-AA-Arg 羧肽酶B能作用 羧肽酶A、B均不能作用 （1）过甲酸氧化法 半胱氨磺酸衍生物 3、二硫键的断裂主要有2种方法 （2）巯基化合物还原法 巯基乙醇或二硫苏糖醇 8mol/L尿素或 6mol/L