蛋白质的性质实验精要.ppt

实验一 蛋白质的性质实验 蛋白质及氨基酸的呈色反应  1.加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识 2.掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理 一、蛋白质呈色反应 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有色物质的反应。 不同蛋白质分子所含的氨基酸残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全一样。 呈色反应并不是蛋白质的专一反应。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物质一定是蛋白质，至少要用2种以上的方法来鉴别。 （一）双缩脲反应 【实验原理】 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。其反应过程如下： 多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。其反应过程如下： 【试剂】 蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍， 通过2-3层纱布滤去不溶物） 2. 0.1%的甘氨酸溶液 3. 0.01%精氨酸溶液 4. 10%NaOH溶液 5. 1%CuSO4溶液 6. 尿素结晶 【实验流程】 双缩脲的制备 少许尿素结晶于干燥试管中 注意： (1)尿素结晶不要取多，约火柴头大小。 (2)在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。 (3)控制加热的时间既不能过长也不能过短。 (4)加热时火不能太大，防止碳化。 (5)铜离子不能多加，否则与氢氧化钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。 （二）茚三酮反应 【实验原理】 在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)，含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。 【试剂】 1.蛋白质样液（与双缩脲反应相同） 2. 0.1%的甘氨酸溶液 3. 0.2%茚三酮溶液 【实验流程】 取试管2支，分别加入蛋白质样液及0．1％甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液0.5ml，混匀后于沸水浴中加热数分钟，观察颜色变化如图所示： （三）黄色反应 【实验原理】 在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为桔黄色的硝醌衍生物,反应为: 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。 【试剂】 1.蛋白质样液（与双缩脲反应相同） 2.浓硝酸 3. 20%NaOH 4. 0.1%石炭酸溶液 【实验流程】 1. 取0.1%石炭酸溶液约1ml放在试管内，加浓硝酸5滴（注意不要弄到手上），水浴加热，观察结果如右图所示： （四）考马斯亮蓝反应 【实验原理】 考马斯亮蓝具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 【试剂】 1.蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） 2.考马斯亮蓝染液 【实验流程】 取2支试管，按下表作 * * 【实验目的】 微火加热 尿素熔解至 硬化 停止加热 看到有白色气体 冷却 加10%氢氧化钠 溶液约1ml 震荡 加入1%硫酸铜溶液2滴 震荡 观察颜色的变化 如图所示 2. 取洁净试管1支，加蛋白质样液 1ml和浓硝酸5滴，出现沉淀，加热，不必至沸腾，沸腾比较危险，则沉淀变成黄色，待试管冷却后，向两管各加20％NaOH溶液使成碱性，观察颜色变化如图所示： 试剂 管号 蛋白质溶液（mL） 蒸馏水（mL） 考马斯亮蓝（mL） 1 0 1 2.5 2 0.1 0.9 2.5 实验结果如图所示： *