蛋白质分离纯化技术精要.ppt

蛋白质分离与纯化技术 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。 蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。 一般程序 预处理 蛋白质的抽提 蛋白质粗分级 蛋白质纯化 预处理 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态，不丧失生物活性。 常用的破碎方法有： 机械方法：如均浆喷射、研磨或超声波 化学法：如去污剂、有机溶剂处理 酶学方法：如溶菌酶处理 蛋白质的抽提 一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。 蛋白质粗分级 采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。 蛋白质纯化 在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。 在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。 蛋白质纯化的常用方法 采用分离和提纯蛋白质的各种方法，主要是利用蛋白质之间的各种特性差异： 根据分子大小不同的分离方法 利用溶解度差别的分离方法 根据蛋白质的吸附性质分离 根据对配基的生物学特异性 根据蛋白质分离 根据分子大小不同的分离方法 透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 离心分离：蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开，经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。 凝胶过滤层析：利用凝胶介质交联度或者孔度（网孔大小）来决定凝胶的分级范围。 利用溶解度差别的分离方法 等电点沉淀和PH值控制：等电点时蛋白质的净电荷为零，溶解度最低。相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。 蛋白质的盐溶和盐析：中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。 有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。 根据蛋白质的吸附性质分离 某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等，具有吸附能力，能够以不同强弱的吸附力吸附蛋白质。 吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。 根据对配体的特异亲和力进行纯化 配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团、分子。如酶的作用底物、辅酶及其结构类似物。 亲和层析，这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。 根据蛋白质带电状态分离 离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带电荷不同进行分离的。 离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。