蛋白质免疫印迹技术精要.ppt

转移电泳设备 Western－blotting 检测抗血清 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。 封闭 脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 一抗、二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法 辣根过氧化物酶EC 1.11.1.7。一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。 它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。 HRP常用的生色底物有： DAB—二氨基联苯胺 TMB—四甲基联苯胺 OPD—邻苯二胺 一般免疫印迹中，显色反应采用生成不溶性产物的底物DAB。 五、实验结果与分析 酶标法显色 化学发光法显色 六、思考题 　1. 影响制备特异性强、效价高的抗血清的因素有哪些？ 　2. 如何保存抗血清？ 3. 如何检测抗血清？原理是什么？ * 免疫应答产物：指免疫球蛋白和各种淋巴因子。 抗原刺激机体产生免疫应答的规律：如抗原的识别和递呈、免疫细胞间的信息传递和作用、基因调控等。 * 也就是说，不是任何物质都有抗原性，也不是凡有抗原性的物质对任何机体都能引起免疫反应。即使同一抗原作用于不同的动物、或者是同种动物的不同个体，所引起的免疫反应可能也是不同的。 * 抗原就是指能刺激机体的免疫活性细胞产生抗体，并在体内外发生特异性反应的物质。 免疫原性：是指抗原对有反应能力的个体引起免疫反应的能力。有没有免疫原性取决于两个因素：一是抗原分子表面有没有特定的化学结构；二是生物机体有没有相应的免疫活性细胞（或抗体）。 * 抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀 环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀 环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。 * 在琼脂糖凝胶中，在一定的pH和离子强度下，可溶性的抗原和抗体在介质中相向扩散，至相对应性抗原与抗体适合比例时，则可出现免疫沉淀线，再根据沉淀 线的种类及特点，鉴别抗原或抗体的性质异同。 抗体的结构 （二）用于免疫的动物 由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。 动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。 一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。 （三）抗原 抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。 为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。 （四）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL左右。 实验中0.2mL，3－4点注射。 皮下注射 （五）佐剂 应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。 佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。 目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。 福氏佐剂（Freund?adjuvant）, 通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。 在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全