蛋白质双向电泳简介精要.ppt

蛋白质双向电泳 简介 双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。1975年,意大利生化学家O.Farrell发明了双向电泳技术,大大提高了蛋白质分离的分辨率而得以广泛应用,至今已经历了快四十年的发展,双向电泳技术已较为成熟,但在基本技术上仍未改变。双向电泳技术包括蛋白样品制备、干胶条水合、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS电泳等步骤。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术 仪器设备 原理 双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。 IPG干胶pH梯度是通过缓冲复合物与聚丙烯酰胺凝胶共价结合形成的,随着凝胶聚合而将pH梯度固定。即使胶条在高电压下进行较长时间的等电聚焦,仍保持稳定的pH梯度。这是高分辨分离所必需的。IPG胶灌注在塑料片上,然后盖上相同大小的塑料片,机械切割成固定大小而易操作的干胶条。第二向电泳分离的重现性有明显提高,主要是因为使用了预制的SDS胶和灌制多板胶的设备,实现了实验系统的标准化,便于实验室内部及实验室之间数据比较和合作。 要用到的试剂 样品裂解液: 7mol/L尿素,4% CHAPS,10mmol/LTris,2mol/L硫脲。 IPG溶胀液: 8mol/L尿素,2%CHAPS,分装成0.5ml/管,-20oC保存。使用前2.5ml IPG溶胀液加入7mg DTT,0.5%IPG缓冲液(3~10L),少量溴酚蓝。 平衡液: 50mmol/LTris-HCl (pH8.8),6 mol/L尿素,30%甘油,2% SDS,少量溴酚蓝。使用前10ml平衡液加入0.1mgDTT。 溴酚蓝溶液 :1%溴酚蓝,50mmol/LTris-HCl,分装成0.5ml/管,-20oC保存。 30%丙烯酰胺贮存液: 30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺,0.45um微孔滤膜过滤后,避光贮存于棕色瓶中4度保存。 凝胶缓冲液储存液： 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8),0.45um微孔滤膜过滤后,4度保存。 SDS电泳缓冲液 :25mmol/L Tris-HCl (pH8.3),192mmol/L甘氨酸,0.1%SDS SDS均一胶各成分用量 步骤 样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS分离蛋白质的检测与匹配分析 样品的制备 取材时应避免因细胞死亡而引起蛋白降解,尽可能快速将材料投入液氮中保存。研磨时,组织样品须在液氮中冷冻,充分研磨成细粉,然后快速加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,充分混匀。对于大多数植物样品制备而言,在液氮磨碎的样品中应快速加入蛋白沉淀剂(如丙酮),并在低温下沉淀(-20oC)和离心(4oC)。 在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制备的药剂必须与等电聚焦兼容。 通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质,然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型或两性去污剂以破坏疏水交互作用。 样品的溶解 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 增加样品溶解性的手段 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-