蛋白质性质精要.ppt

生物化学实验 蛋白质性质 四、蛋白质的变性(denaturation ) 定义： 某些物理或化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。 1. 变性作用的本质 蛋白质变性作用的本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而并不涉及蛋白质一级结构的改变或肽键的断裂 。 生物活性的丧失是变性的主要表现； 构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。 2. 变性作用的特征 （1）生物活性丧失 （2）某些理化性质的改变 失去结晶的能力； 易为蛋白酶水解，因此食用变性蛋白更有利于消化； 无序松散肽链相互交链形成大的絮凝 、凝固、沉淀等； 变性还可以引起球状蛋白质不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低等。 3. 引起蛋白质变性的因素 物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等（表面张力）。 这主要通过能量效应破坏了蛋白质结构维持的次级键，这里的多数方法是作为杀菌、灭酶除杂的主要手段，注意搅拌振荡往往是同时引起泡沫效应，有泡沫的表面张力作用引起的蛋白质变性可发生于实验室，更重要的是在生化工程的蛋白质液体传输、产气发酵等产生的泡沫变性应尽量避免（消泡措施）。 化学因素： 强酸和强碱（破坏解离状态等）、 尿素和胍盐（氢键破坏剂）、 去污剂（破坏疏水键、离子键）、 浓乙醇（破坏疏水键等）、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）和三氯乙酸（与蛋白质不可逆结合形成沉淀）等。 不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同，可根据需要选用。化学变性中后三种多生成沉淀，前三类多为可溶性变性，特别是去污剂（SDS、Tween）和氢键破坏剂（尿素、胍盐、酰胺）可用来蛋白质增溶提取及蛋白质化学特性研究中。 4. 变性作用的意义 对活性蛋白质的生产和应用也有着重要的指导作用。 实践中有时必须尽力避免， 制备有生物活性的酶、蛋白质、激素或其他生物制品（疫苗、抗毒素等）时，要求所需成分不能变性，而不需要的杂蛋白则应使其变性或沉淀除去。此时，应选用适当的方法严格控制操作条件，尽量减少所需蛋白质的变性。有时还可加些保护剂、抑制剂等以增强蛋白质的抗变性能力。 有时则充分利用。如酒精、紫外线消毒，高温、高压灭菌等是使细菌蛋白变性而失去活性；中草药有效成分的提取或其注射液的制备也常用变性的方法（加热、浓酒精等）除去杂蛋白；在 5.蛋白质的可逆变性与复性 当变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。 例如胃蛋白酶加热至80～90℃时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37℃，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的，如大多数的热变性、重金属沉淀和强酸强碱变性是不可逆的。蛋白质变性是否可逆由变性与复性的条件控制和蛋白质种类都有关系，蛋白质高级结构越复杂（多亚基，多结构域）越难以复性。 五、蛋白质的颜色反应 蛋白质在可见光下可分为有色与无色两大类： 有色蛋白质都是含有色素基团的结合蛋白质 常见的有植物的叶绿蛋白（辅基是叶绿素），动物的血红蛋白（辅基为血红素），细胞色素、一些藻类的藻胆色素合和菌蕈色素蛋白质，这些色素基团以卟啉及其衍生物（含镁、铁离子）为主， 亦可有其它的色素及金属鳌合物，常见的还有黄素（结合核黄素）蛋白质等，这类有色蛋白质既构成了色彩斑斓的自然界，又具有重要的功能，同时又可直接观察方便蛋白质研究。 蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 而对于多数（可见光下）无色蛋白质常常需要通过颜色反应进行定性定量分析 1.用于蛋白质定量的颜色反应 ① 双缩脲反应： 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180℃，2分子尿素缩合成1分子双缩脲并放出1分子氨。（P35图） 双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生紫红色络合物，此反应称双缩脲反应（biuret reaction）。 蛋白质分子中含有许多肽键，结构与双缩脲相似，因此也能产生双缩脲反应，所以可用此反应来定性定量地测定蛋