蛋白质样品的制备+生物信息学专业精要.ppt

蛋白质样品的制备 主讲：胡水旺 广东省蛋白质组学重点实验室 2011年10月25日 没有蛋白质就没有生命 蛋白质组学的发展 蛋白质组学(Proteomics) ：是通过大规模研究蛋白质的表达水平的变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究。 蛋白质组学常用的两大技术平台 为什么进行蛋白质样品制备？ 1.混合物中排除非蛋白成分（多糖、脂肪、酚类）的影响。 2.双向电泳的分辨率不够高（1000-5000），需要通过制备样品来提高低丰度蛋白的含量。 3.样本时各种细胞或组织的混杂，而且性状不一。如肿瘤样品中混有血管和基质细胞。 蛋白质样品制备的原则 6.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用； 7.有的研究中必须保持蛋白质的活性； 8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质（核酸、脂肪、色素等）； 9.制备样品的裂解液应该新鲜，不可反复冻融已经制备好的蛋白样品。 蛋白样品制备流程 1.组织或者细胞破碎； 2.分离或沉淀蛋白质； 3.纯化蛋白质或去除杂质。 一.组织或者细胞破碎 破碎方法的选择取决于样品的类型: 1.整体样品：个体小的物种（微生物）； 2.组织样品：需要有选择的采样； 3.细胞样品：贴壁细胞、悬浮细胞、原代培养的细胞等； 4.可溶性样品：血清、尿液、脑脊液、细胞或组织的水溶性提取物 1.整体样品 2.组织样品 3.细胞样品 4.可溶性样品 温和的裂解方法 常用于组成比较简单的样品如细胞、亚细胞器等。 1.渗透裂解法； 2.冻融裂解法； 3.去污剂裂解法； 4.酶裂解法。 1.渗透裂解法 2.冻融裂解法 3.去污剂裂解法 4.酶裂解法 剧烈的破碎方法 常用于难破碎的细胞（如固体组织中的细胞、有坚硬细胞壁的细胞）。 1.超声波裂解法； 2.弗氏压碎器法； 3.研磨法； 4.机械匀浆法； 5.玻璃珠匀浆法。 1.超声波裂解法 常用于细胞样品； 避免产生气泡，保持低温。 2.弗氏压碎器法 3.研磨法 4.机械匀浆法 适合于匀浆固体组织； 分为玻璃匀浆器和电动匀浆器 5.玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁 适合细胞悬液或微生物 蛋白酶活性抑制剂的使用 加入蛋白酶抑制剂作用：防止修饰、减少降解。 1.变性剂（尿素和硫脲）； 2.苯甲基磺酰氟（PMSF ） ：不可逆抑制剂，抑制丝氨酸和部分半胱氨酸蛋白酶； 3.AEBSF：不可逆抑制剂，和PMSF类似; 4.金属蛋白酶抑制剂：可逆抑制剂，如EDTA、EGTA，抑制金属蛋白酶； 5.肽蛋白酶抑制剂：可逆抑制剂，如亮抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂； 6.甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）：不可逆抑制剂，抑制许多丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶; 7.Benzamidine：抑制丝氨酸蛋白酶。 二.分离和提取蛋白质 1.硫酸铵沉淀（盐析）； 2.三氯乙酸沉淀（TCA沉淀）； 3.丙酮沉淀； 4.在丙酮中用三氯乙酸沉淀； 5.用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀。 1.硫酸铵沉淀（盐析） 步骤：高盐溶液能使蛋白质聚合。缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌后通过离心沉淀蛋白。 适用于样品的预分离或富集蛋白。 缺点：残留的硫酸铵会干扰IEF，需要去除。 2.三氯乙酸沉淀（TCA沉淀） 原理：三氯乙酸浓度达到10%-20%时，蛋白质可以在冰上沉淀。 缺点：蛋白质沉淀后难溶解，残留的TCA需要用丙酮或者乙醇清洗沉淀。 3.丙酮沉淀 步骤：在提取物中加入3倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20℃沉淀至少2小时，在离心沉淀蛋白质。 优点：残留的丙酮可以空气干燥或冻干除去。 4.在丙酮中用三氯乙酸沉淀 步骤：10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（20mM DTT） ，只属于在-20 ℃沉淀45分钟，通过离心沉淀蛋白。并用含20mM DTT的冰丙酮清洗沉淀。 缺点：存在沉淀难溶解问题 5.用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 步骤：用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀，然后用丙酮清洗。 适用于提取浓度低的样品如植物、尿液。 缺点：沉淀不容易溶解。 蛋白质裂解技术 适宜裂解剂能够提高双向电泳的分离效果。 裂解剂分为三个成分 1.离液剂：破坏氢键等次级键，使肽链伸展，暴露疏水中心。如尿素或者硫脲， ； 2.表面活性剂：破坏疏水作用。如SDS（阴离子去污剂）、CHAPS 、SB3-10（两性离子去污剂）、Triton X-100 和NP-40（非离子去污剂）； 3.还原剂：断裂二硫键。如巯基乙醇、二硫苏糖醇、三丁基膦。 裂解液的组成 1.脲+一种或者几种去污剂+还原剂+两性电解质 2.裂解离心前需要室温平衡 样品的预分级 1.提高低丰度蛋白的上样量和检测。 2.可