蛋白质组学研究进展精要.ppt

The Australian Proteome Analysis Facility (APAF) Human Proteome Organisation （HUPO） * Food and Drug Administration(FDA) * 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 * Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世纪50年代所创立。分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在pH9．0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物：随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH．氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。Edman降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。而且对大多数氨基酸残基而言，30 min的耦合反应时间、5 min的切割反应时间都已足够。 * 所带的同位素标记为含8 个氢原子的(d0) 轻试剂和8 个氘原子的( d8 ) 重试剂。一般的实验步骤是将一个蛋白质样品用轻试剂标记, 另一个样品用重试剂标记, 然后将两个样品混合, 经胰蛋白酶或Lys-C 水解蛋白得到肽片段。混合的样品用抗生物素蛋白亲和层析法分离。这些肽段还可以进一步通过反向毛细管液相色谱和MALDI-TOF或QTOF2质谱进行分析,质谱后得到的相差a 的同位素分子质量峰,这些峰的比率可以作为与原样品各个蛋白相关量的测量尺度, 如一对峰相差8 个质量数,则为同一种蛋白质, 由D0和D8 峰的相对强度进行相对定量。 * 编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因 经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长 * cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 * 所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定 造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。 * 同位素亲和标签技术（ICAT） 二、蛋白质组功能模式的研究方法 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。 主要研究目标 （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 磷酸化 …… 修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大 研究面临的困难： （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用（蛋白质复合体、多蛋白质网络） 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。 1．酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system） 转录激活因子GAL4的特点 DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB):N端含NLS和与酵母