蛋白质组研究技术精要.ppt

第一向进行等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）,由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条（IPG）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡 第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息 返 回 蛋白质的检出限与染色方法、起始加样量的关系 以6×107个细胞得到1mg可溶酵母蛋白计算。 返 回 银染（1ng） 考马斯亮蓝染（100ng） 蛋白质的丰度 拷贝数/细胞 细胞数 细胞数 10 1.2×109 1.2×1011 100 1.2×108 1.2×1010 1000 1.2×107 1.2×109 10 000 1.2×106 1.2×108 100 000 1.2×105 1.2×107 激光捕获显微切割示意图 返 回 返 回 2.3 样品预分离（pre-fractionation) （1）分步提取法（sequential extraction） 原理：蛋白质的溶解度差异 采用3种不同的提取液进行分步提取和分别电泳；实际上是增加了溶解性能不同的第三维分离 （2）多间隔电解法（multi-compartment-electrolyser） 电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极液，由阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集。 3.碱性蛋白质的分离与检测 3.1 很难被分开：商业化的IPG胶条的pH范围通常在3-10，等电点超过10的蛋白质很难被分开。目前已经有pH范围到12的IPG胶条，从而得到了部分的解决 3.2 大部分的细胞提取物是酸性蛋白质：去除酸性蛋白质改善碱性蛋白质的分离与检测。 可以制备等电聚焦预分离，将碱性蛋白质富集，再采用碱性pH梯度胶进行分离 4. IPG胶条的改进 4.1 胶条的pH范围在不断变窄：改善了2-DE的分辨率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，而且可以针对不同样品选择不同的胶条 4.2 胶条的pH范围也在不断扩大：改善了碱性蛋白质的分离 4.3 不同长度的胶条：通常采用的是18cm的胶条，可以达到2000种以上蛋白质点的分辨率；24cm、40cm 5.高通量与自动化 5.1 蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化：集中在2-DE后的样品处理和蛋白质的识别 5.2 自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操作，缩短了时间，提高了效率；提高了样品处理的重复性，避免了手工操作易产生的污染 5.3 可同时运行12块胶的二向SDS电泳槽已经研制成功并商品化 2-DE，染色，图像分析 自动MS样品分析 自动蛋白酶解，多肽回收，点样于MS样品靶 自动采集数据，数据库检索，蛋白鉴定 胶上蛋白点自动切割，置于96或384孔板 蛋白质识别过程的自动化流程 5.4 分子扫描（molecular scanner）：将一个固相化了胰蛋白酶的PVDF膜插入2-DE电泳胶和另一个PVDF膜之间，后一个PVDF膜作为收集膜。当对上述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个PVDF膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿过带有固相化胰酶的PVDF膜，被第二个PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MS做肽质量指纹谱分析。 实现了2-DE后的样品处理与质谱分析一体化；肽段数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与鉴定效率受到影响。 6. 2-DE的局限性 实验设计：样本间的异质性以及组织中多种细胞的并存，将影响实验结果的可靠性。激光捕获显微切割的方法（laser-capture microdissection, LCM）：单一细胞 重复性：是2-DE方法存在的主要问题 动态范围：有限的动态范围与低拷贝蛋白质的难以检测也是2-DE目前尚未完全解决的问题。放射性同位素标记 蛋白质的丢失：疏水性蛋白质、分子质量大于100kDa的蛋白质 通量和自动化：图像分析仍然是瓶颈 二、色谱－质谱技术 1.二维色谱－串连质谱技术（2D-HPLC-MS-MS） 1.1 二维色谱分离蛋白质和多肽 优点 缺点 2-DE 高分辨率，1000个蛋白质 可