第3章 细胞工程精要.ppt

微生物细胞融合工艺 菌种选择 扩大培养 大量菌体细胞 ①高渗溶液 (SMM液、DP液) ②脱壁酶 (蜗牛酶、溶菌酶) 原生质体 融合剂(PEG) 原生质体融合 去融合剂 融合原生质体 培养基 细胞壁再生 菌落繁殖 融合体筛选 影响微生物细胞融合的因素 微生物原生质体融合受下列因素的影响： ①参与融合菌株的遗传性状。 参与融合的菌株一般都需要有选择标记，标记主要通过诱变获得。在进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过高，则不宜作为选择标记。 ②制备原生质体的菌龄。 制备细菌原生质体应取对数生长中期菌龄的细胞，因为此时的细胞壁中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。 ③培养基成分。 细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。培养用基本培养基比用完全培养基效果更好。 ④细胞的前处理。 由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆菌。在棒状杆菌制备原生质体前，菌体前培养需要添加少量青霉素以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞壁对溶菌酶的抗性。 1 原核细胞的原生质体融合 细菌 革蓝氏阳性菌：肽聚糖约占细胞壁成分的90% 革蓝氏阴性细菌：部分肽聚糖，大量脂多糖 利用溶菌酶制备革蓝氏阳性菌的原生质体 原核细胞的原生质体融合方法同植物原生质体融合 2真菌的原生质体融合 真菌原生质体制备： 真菌原生质体融合：PEG 复习参考题 名词解释 问答题 1.如何理解植物全能性的概念？ 2.多利羊诞生的原理以及意义？ 3.单克隆抗体产生原理？ 4.干细胞的特点，分类以及意义？ * * * 第三节 动物细胞工程 人、鼠细胞融合 3.电激诱导融合 2 化学诱导融合 同植物原生质体融合 三 单克隆抗体技术 1 免疫系统 免疫系统三道屏障 皮肤 非特异性免疫 特异性免疫 细胞免疫：不产生抗体 体液免疫：产生抗体 体液免疫的特征：机体产生了针对浸入细菌的抗体。 抗原决定簇 抗体：是由体内一种免疫细胞即B淋巴细胞分泌产生的特殊蛋白质，能专一性识别细菌表面的特殊化学结构。 2 抗原和抗体 抗原（antigen）：进入动物体内诱发抗体 产生的外源物质 抗原的特性： 从未接触过的外源异物 分子表面有稳定的结构基团作为识别位点 相对分子量愈大，抗原性愈高 抗体与抗原间的反应是特异的 3 B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术 克隆选择理论：一种B淋巴细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子，从一个单克隆细胞产生的抗体分子就是单克隆的，这种单克隆抗体具有独特的均一结构（1957年，Burnet ）。 1975获得了由一个克隆产生的抗体即单克隆抗体 杂交瘤 B淋巴细胞（免疫小鼠脾细胞）： 骨髓瘤细胞（小白鼠的骨髓瘤细胞）： 产生抗体，但不能体外增殖 不能产生抗体，可体外无限增殖 3 B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术 产生B淋巴细胞杂交瘤的技术过程 ： 四 细胞核移植与动物克隆 1.细胞核移植 核移植技术：是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性系杂交生物新品种的一项技术。 2. 开展细胞核移植的目的： （1）异种细胞核质之间的遗传相互关系研究 ； 鱼 移植 鲤鱼囊胚期细胞核 鲫鱼去核受精卵 检测 形态：口、须、咽像鲤鱼，脊椎骨数目像鲫鱼，侧线鳞片数为中间类型 分子鉴定：血清和血红蛋白的电泳分析 杂种鱼 发育 （2）脊椎动物克隆――细胞核遗传全能性研究 。 是否具有遗传全能性？ 处于个体发育各个时期、履行不同职责的细胞， 它们细胞核的遗传潜能是否一样？ Briggs 在1952年的实验：蛙囊胚期细胞核克隆蛙成功；而胚胎发育后期、蝌蚪期及成蛙的细胞核克隆失败。 胚胎发育后期及成体细胞核不具全能性 尚未分化 已分化 1981年Illmenses用小鼠幼胚细胞核克隆出小鼠 1986年Willadsen等用早期羊胚胎细胞核克隆出羊 1964年南非科学家Gurdon取得了突破 体细胞克隆终于在1997年取得重大突破 胚胎早期细胞核具全能性 Gurdon （ 1964）：非洲爪蟾蝌蚪肠壁细胞核移植试验 ； Wilmut （1997）：利用6岁绵羊乳腺细胞成功克隆出“多莉羊” 到目前为止，用体细胞克隆技术已成功克隆出小鼠、牛、 　　　　　　山羊、绵羊、猪、兔、猫、猴子、骡子、马 　　　　　　等动物。 动物的体细胞核具有遗传全能性 英国罗斯林研究所的维尔穆特成功克隆了多莉羊（Nature, 1997, 385, 8