血清蛋白电泳醋纤电泳圆盘电泳精要.ppt

* 实验二 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。 在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。 一、电泳技术 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 影响电泳速度的因素 1、影响电泳迁移率的外界因素： 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素： 样品所带净电荷的量 样品的大小和形状 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义 二、实验目的 本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。 方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。 三、实验原理 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 γ β α2 α1 清蛋白 蛋白质名称 等电点 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 人血清蛋白质的等电点及分子量 1.实验材料：未溶血的人血清 2.实验试剂： 巴比妥缓冲液 氨基黑10B0.5％染色液 漂洗液 透明液 3.实验器材： 醋酸纤维薄膜（2×8cm） 常压电泳仪 镊子 点样器 玻棒 粗滤纸 培养皿 吸量管 直尺及铅笔 四、试剂及器材 1. 准备 醋酸纤维素薄膜的预处理： 将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划线即为点样线并作好标记。 五、试验方法 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。根据电泳槽膜支架的宽度，裁减尺寸合适的率纸条，放入电泳槽，待滤纸条湿润后，用玻璃棒挤压排气，使滤纸紧贴膜支架。 2. 点样（关键） 取出浸透的薄膜，平放在滤纸上(无光泽面向上)，用滤纸轻轻吸去多余的缓冲液，薄膜的粗糙面向上平放在点样模板上，底边对齐，点样区距负极1.5cm。点样时，用磨光的玻片蘸取血清后，均匀的涂抹在点样区，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。（见图） 注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。 另外操作过程要防止指纹污染。 3. 电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，使膜平衡10min。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度。通电10min-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度，电泳时间50min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。 点样端 1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板 4. 染色 电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。 5. 漂洗 用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每10min左右换一次液，连续更换数次，直至背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去