血清学试验精要.ppt

第十一章 血清学试验 卢军霞 第一节 血清学试验概述 一、概念 抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。 它既可以发生在体内，也可以发生在体外。 在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。 体外的抗原抗体结合反应主要用于检测抗原或抗体，用于免疫学诊断。 因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。 第一节 血清学试验概述 二、特点 特异性与交叉性 敏感性 反应的可逆性 反应的二阶段性 最适比与带现象 用已知测未知 第一节 血清学试验概述 三、影响血清学试验的因素 电解质 温度 酸碱度 震荡 杂质和异物 第一节 血清学试验概述 四、应用及发展趋向 血清学试验在医学和兽医学领域已广泛应用，可直接或间接从传染病、寄生虫病检出相应的抗原或抗体。 血清学试验还广泛应用于生物活性物质的超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面。 血清学试验也用于基因分离，克隆筛选，表达产物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分子生物学研究的重要手段。 二、分类及方法 1、直接凝集试验 ⑴玻片法 ⑵试管法 2、间接凝集试验 ⑴间接血凝试验 ⑵乳胶凝集试验 （3)协同凝集试验 1、玻片法凝集试验 方法评价: 定性试验，简便和快速，敏感度低 临床应用: 菌种鉴定、血清学分型、血型鉴定 （二）、间接凝集反应 间接凝集反应(indirect agglutination) 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象 可分为四类：正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、乳胶凝集反应、协同凝集反应 2、胶乳凝集试验 一种以聚苯乙烯胶乳为载体颗粒的间接凝集反应。 通过物理吸附、化学交联的方式结合蛋白质抗原/抗体 分为试管法和玻片法 胶乳为人工合成的载体，性能比红细胞稳定，均一性好，但与蛋白质结合能力以及聚集性能不如红细胞，因此作为间接凝集反应，胶乳凝集的敏感度不及血凝试验。 3、协同凝集反应 抗体致敏载体，载体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA） SPA具有与IgG的Fc段结合的特性。 单向免疫扩散 双向琼脂扩散 双响琼脂扩散 抗体效价滴定 对流免疫电泳 对流免疫电泳原理 对流免疫电泳结果判定 对流电泳方法评价 火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis, RIE) 火箭免疫电泳 火箭免疫操作步骤 火箭免疫结果 火箭免疫电泳方法评价 免疫电泳(immunoelectrophoresis, IEP) 免疫电泳示意图 免疫电泳操作步骤 免疫电泳方法评价 补体结合反应 补体结合反应 免疫荧光技术 免疫荧光法 荧光标记法 酶标记抗体技术（免疫酶技术） 酶标记抗体技术（免疫酶技术） 酶联免疫吸附试验（简称ELISA） 直接法 间接法 斑点酶联免疫吸附试验 免疫转印技术(immuno-blot) 免疫转印技术操作步骤 免疫转印技术方法评价 第五节 中和试验　　 中和试验 在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。 1为阳性 2为弱阳性 3/4为强阳性 简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高8~10倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。 火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清学试验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。 1. 制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷却至55℃左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。 2. 打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距2mm。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10μl。 3. 电泳 样品孔放负极侧，电压8~10V/cm或电流3~5mA/cm，电泳6h。 4. 观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。 5. 绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度 若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合