无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用讲解.ppt

# 无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用 无细胞蛋白合成体系 是一种快速、高效的体外合成蛋白的手段。通过在细胞抽提物的酶系中补充转录与翻译所需各类底物和能量物质从而完成目标蛋白的合成。 优点： 无膜阻隔 基因和聚合物浓度可控性 报告物易量化测量 能直接以PCR产物为模板 具有高通量性 缺点： 反应持续时间短 产率低 必须补充价格昂贵的能量物质与底物 反应体系体积小 构建系统的考虑因素 物种对象 原料的供应 制备过程的难易程度 蛋白产量 蛋白的复杂度 下游处理简易程度 成本高低 物种对象——不同物种无细胞体系的比较 完整的无细胞蛋白表达系统的构成 转录 翻译 蛋白折叠 能量代谢 理论上所有来源于微生物、植物或动物细胞的抽提物，都能满足蛋白表达的基本需求，具有构建无细胞蛋白表达系统的潜力。但是不同物种来源的无细胞系统的表现差异巨大。因此对象的选择成为构建系统的首要考虑因素。 物种对象——不同物种无细胞体系的比较 真核 WGE是用小麦胚芽制备而成，在真核系统中产量最高，但仍旧缺乏糖基化等翻译后修饰手段。 RRL系统、ICE系统以及HCE系统蛋白产量只有数十微克/毫升。 大肠杆菌系统（目前最受欢迎和普遍使用的系统）的优势： 价格低 制备容易 表达量高 物种对象——真核无细胞体系 缺点 培养难度大 花费更高 细胞抽提物的制备过程更为繁琐 优势 可以表达复杂蛋白 实现翻译后修饰 无细胞蛋白表达技术关键突破 无细胞系统中能量供应方式 无细胞蛋白表达技术的进步主要归结于3个方面的突破：合适的底物供应、平衡稳定的反应环境、抑制性副产物的去除。 反应模式 批次性无细胞反应 维持无细胞反应正常进行的底物与能量物质在反应中消耗迅速而得不到补充，反应持续时间很短，蛋白产率往往只有数μg/mL，严重阻碍了无细胞蛋白表达技术的应用与推广。 连续交换式无细胞表达反应（CECF） 反应体系： 反应模块（负责表达目标蛋白） 补充模块（负责为无细胞反应补充消耗的能量和底物） 两模块之间由一层具有选择透过性的半透膜分隔开。 缺点： 反应体积大 反应时间长 并不是常规无细胞表达手段的首选方式 产量成本高 表达水平达到3-6mg/mL 无细胞体外表达蛋白的折叠 影响蛋白折叠的因素非常广泛，在无细胞中帮助蛋白的正确折叠的本质手段就是要尽量模拟蛋白在胞内表达的真实环境。目前并没有一种手段可以解决所有问题，需要根据目标产物的特点，采取相应的调控反应环境方法，帮助蛋白质在无细胞中正确折叠，提高生物活性。 如有相关报道表明在无细胞体系中直接加入分子伴侣就成功表达了复杂蛋白。 在蛋白表达时加入非天然氨基酸 1 类病毒颗粒的表达 2 3 药物靶标膜蛋白表达 4 高通量无细胞技术 无细胞蛋白表达系统在生物制药中的应用 将非天然的p-乙酰苯丙氨酸（pAcF）引入生长 因子（hGH）中的特定位点，使其可以和聚乙 二醇实现共价结合。 1 将β干扰素中蛋氨酸替换成非天然类似物 并对其特定位点进行PEG修饰，得到的产 物在治疗多发性硬化症时给药方式更加简 便，显示出极高的耐受性。 2 在蛋白表达时加入非天然氨基酸 提供额外的基团以便对蛋白质进行化学修饰 目前全新领域的重组蛋白药物研发越来越难，重磅药物基本都是基于蛋白药物升级，基本要经历蛋白修饰这一过程，而无细胞技术可以便捷可控地添加各种非天然氨基酸实现常规重组表达后难以解决的复杂修饰过程，日益显示出这方面的优势。 类病毒颗粒的表达 类病毒颗粒(VLPs) VLPs是一类大小在25-100nm，由一种或多种结构蛋白自组装成的 复合体。由于其结构上类似于病毒颗粒，能引起免疫应答，但是 VLPs不含有遗传物质，不能自我复制，可以成为一种安全的疫苗。 无细胞系统在VLPs上的应用 由于胞内系统难以大量产生结构高度一致的亚基蛋白，以及纯度低等 限制性因素，因此直接合成病毒颗粒非常困难，而体外无细胞系统可 以克服上述限制性因素。无细胞自身的一些特点更可以大大扩展VLPs 的应用范围。VLPs根据其渗入非天然氨基酸的比列和位点，可以同时 用多种手段对其进行修饰来提高VLPs的性能。一些研究不断证明无细 胞蛋白表达系统在利用VLPs进行药物传递和疫苗开发上有很高的应用 价值和潜力。 #