#Lipo转染.doc

Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项 2010-07-10 16:16 Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000 ?? Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。 特点???? 两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基 操作流程???? 事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。） 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。 混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。在室温保温20分钟。 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 ??? 对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。 适用细胞株范围???? 不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen网址（/content.cfm?pageID=9559fuseaction=CellLines.dsp_searchRange） 适用的核酸类型和DNA大小????? 有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染，这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛，无论是基因表达分析的DNA转染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是，最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题，太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。 用量和价格???? 好东西往往不便宜。可是在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。Lipofectamine 2000用的剂量大吗？价格如何？根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipof