拟南芥中离子转运蛋白载体构建和烟草转化.pdfVIP

第35卷第6期 上海师范大学学报 (自然科学版) Vo1．35，No．6 2006年 12月 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) 2006，Dee． 拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化 钟晓丽，朱 骏，张永明 (上海师范大学 旅游学院。上海 200234) 摘 要：植物修复是利用植物富集重金属离子及其化合物，并通过组织代谢去除环境污染物 的环境修复技术．克隆了拟南芥中的两个金属离子转运蛋白基 因ZAT1和 馏n 并转化烟草， 经PCR及GUS组织化学染色鉴定，zAn和 n基因都已整合进表达载体，并获得 了GUS染 色阳性植株．这些工作为获得富集重全属离子的转基因烟草奠定了基础，将有效地促进植物修 复技术的发展和应用． 关键词：植物修复；重金属离子；载体构建；烟草转化 中图分类号：X505 文献标识码：A 文章编号：1000-5137(2006)06．．0087-06 U 引 舌 近年来，在矿产资源被大量开采利用、工业生产迅猛发展和化学药品广泛使用的同时，重金属污染 已日益成为威胁人类健康，影响人类生活质量的严重社会问题和环境问题¨，2J．植物修复技术作为一个 低成本、高效率、非侵入、符合审美观的技术，可部分解决这一问题并且备受人们的关注 I4J．但 目前许 多用于修复的超量积累植物存在生长缓慢、植株矮小、地上部生物量小等不足难以大规模应用．目前，利 用转基因手段将重金属富集相关基因转入高生物量植物以改变其对重金属吸收、转运、积累和忍耐的机 制，从而提高植物对重金属的富集能力．植物吸收重金属离子和解毒的分子机制包括螯合作用_5圳及跨 膜转运蛋白的作用m ． 迄今为止，拟南芥中部分重金属离子的转运蛋白已被克隆．馏n 基因编码了一个 Fe¨转运蛋白， 在酵母中表达能提高其对 Fen的摄取作用，该基因是包括一个金属结合域的完整的膜蛋白，并且在铁 缺乏诱导下，在根中特异表达 ¨，ZAT1基因则是根据动物中同源的ZnT基因从cDNA文库中克隆到． 该基因有398个氨基酸组成，包括了6个跨膜结构域．在高浓度的zn 培养基中，过量表达该基因的拟 南芥转基因植株对zn 有较高的耐受性，而且在其根部有大量的zn 积累 ls]．本研究从拟南芥中克隆 了ZAT1及馏n ，将其cDNA接上强启动子35S构建到过量表达载体中，并转入烟草表达，以提高转基 因植物的超富集能力，并可利用此实验体系开发高效的转基因植物修复系统． 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 植物材料及质粒和菌种 烟草革新 l号(Nicotianatabacumvar．GexinNo．1)(本实验室提供) 收稿 日期 ：2006-09·12 作者简介：钟晓丽(1982一)，女，上海师范大学旅游学院硕士研究生；张永明(1958一)，男，上海师范大学旅游学院 教授，博导． 上海师范大学学报 (自然科学版) 2006越 pRTL22，pCAMBIA1301(本实验室提供)． E．coliDH5a，农杆菌EHA105(本实验室提供)． 1．1．2 工具酶与化学试剂 限制性内切酶和其他基因工程工具酶购自13本Takana公司，其他试剂为美国Sigma公司产品或国 产分析纯试剂． 1．2 方法 1．2．1 无菌苗的培养 烟草革新 1号烟草种子用质量分数70％的乙醇浸泡 1min，无菌水洗两次，10％的次氯酸钠消毒 15min，无菌水冲洗3—5次，在无菌滤纸上吸干残余水分，接于1／2MS培养基上，置于26~C暗培养箱中， 待出芽后置于光照条件培养，每天光照16h，光照强度50Em S ．幼苗长大后取其叶片浸染． 1．2．2 载体构建 首先，利用TAIR(http：／／www．arabidopsis．org)数据库下载了ZAT1及 n基因的cDNA序列，设计 了特异性引物： n F：CTAAACACACAACAATCCAAA TIR：CGGTAATATGTCArITYAAAATAC ZA71F：ATGGAG