PCR反应原理.ppt

聚合酶链反应原理(Polymerase Chain Reaction , PCR) PCR反应原理和反应过程 １、变性（denaturation） 2、复性(renaturation)（退火，annealing） 系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度 3、延伸（extension） 常用的荧光定量PCR方法 SYBR Green I Taqman水解探针 SYBR Green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有与双链DNA结合后才发荧光 SYBR Green I 工作原理 荧光定量PCR与常规PCR的区别 常规PCR技术 对PCR扩增的终产物进行定性及定量分析 荧光定量PCR技术 实时监测PCR扩增反应中每一个循环的产物 定量分析 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 实时荧光定量PCR的特点 特异性强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 自动化程度高、操作简单 * 1985年 美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术 1988年 美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化 1993年 Kary Mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖 1995年 定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实 PCR技术的诞生与发展 Kary Mullis （一）PCR基本组成： 模板DNA 引物 4种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 其他（Mg2+、化学物质等） （二）DNA的体外复制的步骤： 1、变性（90℃-96℃） 2、退火（25℃-65℃） 3、延伸（70℃-75℃） 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。 在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）作用下，以dNTP为原料，从5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 SYBR 与dsDNA 结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧光 未结合的SYBR green I TaqMan Probes（探针） 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA TaqMan 探针的机理 DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测 TaqMan Probes工作原理 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 Threshold 104 103 102 *