pet表达系统.doc

对于全世界许多研究者， Novagen 的 pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此在加入 T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG 诱导表达；也可通过 l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供 T7 RNA 聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统 ( 如 tac 、 lac 、 trc 、 pL) 有困难的许多基因已经在 pET 系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% 。 　　 新开发的 T7 驱动表达技术以 pETBlue TM 系统为代表。 pETBlue 载体包括了 pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 DNA 操作的方面更为方便。 pETBlue TM 系统：新一代 T7 表达载体 　　 pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和 T7 驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌 tet 启动子的反义方向插到 lacZ a - 肽编码区，因此可进行蓝 / 白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的 T7 转录和翻译信号使表达成为可能。与标准 pET 载体一样，通过转化 λ DE3 溶原菌并用 IPTG 诱导或通过 l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。 优点 · 蓝 / 白斑筛选，便于克隆 · 高拷贝数，质粒 DNA 高产 · 以 AccepTor TM 载体或 perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速 PCR 克隆 · 目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性 · 表达水平与经典 pET 载体相同 · 用 Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。 PET 系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌 　　 pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 · 是原核蛋白表达引用最多的系统 · 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 · 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 · 提供各种不同融合标签和表达系统配置 · 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 · 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物 · 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pETBlue TM 系统 T7 驱动的严紧控制表达、蓝 / 白斑筛选、质粒产量高 　　新颖的 pETBlue TM 系统兼有广受欢迎的蓝 / 白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及 pET 载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝 / 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子 ( tet ) 驱动 lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的 T7 启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（ MCS ）破坏了 lacZ a - 肽的表达，在 NovaBlue 菌株中当存在 x-gal 时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于 T7 驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于 tet 启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于 pET 载体， pETBlue 质粒上高拷贝 PUC 复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。 　　如果插入序列相对于 T7 lac 启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求， pETBlue 载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用 l CE6 （ l pL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组 pETBlue 质粒到宿主菌 Tuner TM (DE3)pLacI 或 Origami TM (DE3)pLacI 中并用 IPTG 诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因，并通过相容的 pLacI 质粒提供足够 lac 阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达