磷脂酶Dδ参和植物的低温驯化过程.doc.ppt

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 541–547, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.003 磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程 摘要 对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶Dδ (PLDδ)基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后, 比较2种基因型植株的抗冻性。结果发现, 经低温驯化的PLDδ敲除突变体的抗冻性明显低于野生型, 而未经低温驯化的PLDδ敲除突变体与野生型的抗冻性没有显著差异, 表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。对PLDδ的作用途径进行分析, 发现PLDδ在低温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节, 对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用, 但是参与低温信号转导物质ABA诱导抗冻性的过程。 关键词 低温驯化, 磷脂酶Dδ, 信号转导 磷脂酶Ds(phospholipase Ds, PLDs)是在植物中广泛分布的酶类。 它们能够水解磷脂产生磷脂酸(PA)和1个自由头基。在拟南芥中已经确认了12个PLD基因, 即PLDα(3)、β(2)、γ(3)、δ、ε和PLDζ(2)。PLDδ在衰老叶片以及脱水、高盐等环境胁迫下有高的表达量。它的激活除了需要Ca 外, 还需要油酸, 激活后优先水解的底物磷脂是磷脂酰乙醇胺。 近年来, 人们用突变体开展的研究揭示出PLDδ参与水分胁迫、氧化胁迫和冰冻伤害等多种反应过程。 2001发现PLDδ及其产物PA参与脱水胁迫的信号转导。 2003发现, PLDδ与其产物PA降低拟南芥中H2O2诱导的细胞程序化死亡, PLDδ基因敲除植株对胁迫更为敏感。 2004发现PLDδ基因被敲除的拟南芥抗冻性下降, 而PLDδ超表达的拟南芥抗冻性则增强, 表明PLDδ对植物的抗冻性起正调节作用。 研究还揭示出PLDδ在植物受胁迫后恢复过程中涉及大量的细胞骨架重组和膜运输过程, PLDδ与微管骨架结合, 它的激活是启动细胞骨架重组的关键步骤。 2008还发现在冻害后的恢复阶段, PLDδ的激活减缓了质体与非质体中脂质的大量降解, 从而提高了植物的抗冻性。 冻害是主要的环境胁迫因素之一。 低温驯化是植物感受、传递低温信号, 引起低温适应性反应从而提高抗冻性的过程。低温驯化过程中植物体内发生许多生理与生化变化. 渗透调节物质大量积累, 细胞渗透势降低, 以防止冻害胁迫下胞间结冰引起胞内失水从而对原生质造成脱水胁迫; 抗氧化酶活性增强, 抗氧化物质含量增加, 以清除活性氧对生物膜系统的氧化胁迫, 增强细胞膜的稳定性。 内源脱落酸水平增加, 参与植物的低温信号转导过程。 低温驯化过程还包含复杂的基因表达变化。本研究证实PLDδ是参与植物低温驯化过程的基因, 并从抗氧化酶活性调节、渗透调节和ABA信号转导过程等角度探讨了PLDδ基因参与低温驯化过程的途径。 1 材料与方法 1.1 实验材料 实验材料为哥伦比亚生态型的拟南芥野生型和PLDδ基因敲除的纯合突变体。将拟南芥种子播于MS培养基中, 在4°C条件下春化处理2天后, 放于光照培养箱中正常培养。 1.2 方法 1.2.1 低温驯化与冻害胁迫处理 将培养24天的拟南芥植株放于生长箱中进行低温驯化。驯化条件: 温度4°C, 光照强度30 μmol·m ·s , 培养3天。利用人工霜箱进行冻害胁迫处理,调查存活率。 1.2.2 离子渗漏率的测定 按照Welti等的方法测定离子渗漏率。在冻害胁迫处理后, 将植株取出, 置于4°C下保存24小时。然后, 取其叶片, 加入去离子水, 在23°C水浴中轻微振荡1小时, 测定初电导值。再将含有叶片的溶液在100°C下煮沸10分钟, 冷却至23°C, 测定总电导值。 离子渗漏率＝初电导值/总电导值×100%。 1.2.3 ABA处理与抗冻性鉴定 ABA处理采用根施方法。对培养22天的拟南芥野生型与突变体植株, 用30 μmol·L 的ABA溶液浇透培养基质。处理4天后鉴定植株的抗冻性: 将处理与对照植株置于人工霜箱中, 快速降温至4°C(10分钟内从室温降至4°C), 再以3°C/小时的速率降温至–2°C(保持3小时, 并喷少量的水防止出现过冷却状态)。然后以2°C/小时的速率降温至–8°C、–10°C、–12°C、–14°C和–16°C, 并分别保持1小时。将不同温度下处理后的植株取出, 置于4°C培养箱中解冻24小时后, 测定处理和对照植株的离子渗漏率。之后, 置于正常生长条件下培养, 10天后照相记录。 1.2.4 渗透调节物质的测定 脯氨酸含量的测定采用酸性水合茚三酮比色法; 用蒽酮比色法测定可溶性糖含量。 1.2.5 抗氧化酶活性的测定 超氧化物