滤纸片干血斑技术精要.ppt

2014年3月20日 2010年新规范培训会 艾滋病阳性产妇分娩婴幼儿早诊标本的采集 滤纸片干血斑技术 概述 滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体。 全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑（Dried blood spots，DBS） ，有很好的生物稳定性和安全性，便于储存和运输。 特别适用于发展中国家边远地区的样本采集、贮存与运输。 1973年，国外就开始研究用滤纸收集血样用于疾病的研究。 概述 国家艾滋病参比实验室（NARL）从2004年开始，应用滤纸片干血斑检测HIV-1抗体、DNA、基因分型与病毒载量测定等方面的研究。 概述 目前国际上最常用：Whatman903滤纸干血斑采集卡。 该卡是Whatman(沃特曼)公司特制的棉花制片。由美国疾控中心批批检合格后上市，被WHO等国际组织公认为采集血样的最佳载体。 FTA（干血点采样） 物品准备 耗材储物柜：干燥、整洁、安全、方便取用，存放样本制作所需的相关耗材。 耗材： 无粉手套 干燥架 药棉或棉签和纱布 采血针 滤纸采血片、信息卡 污物桶 样品采集 填写滤纸卡：信息完整，以免混淆样品。 确定采血部位： 脚后跟采血法： 6周~4月或小于5kg的婴儿 脚大拇指采血法： 4~10月或5~10kg的婴儿 手指尖采血法：大于10月或大于10kg的婴儿 静脉采血法 样品采集 样品采集 血样采集完毕后，将制成的滤纸片干血斑采集卡在干燥、清洁、平整、无吸水性的桌面放置3~4小时风干。或将采集卡放置于专业纸质干燥架上自然风干。 不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法（如烘干机）加速干燥。 静脉采血：用移液器移取80μL全血，对准采样圈中心缓慢将血液滴加在滤纸上，避免气泡产生。 DBS有效性的判断 有效样品 DBS保存 样品风干后，将每张滤纸片采集卡分别装入薄玻璃袋。 装好后放入封口袋，多个薄玻璃袋可以装入一个封口袋，同时放进干燥剂和湿度卡。 轻轻将封口袋的空气积压出去，封口。 冷藏干燥－20℃保存。 DBS递送 DBS采集卡可以专人送样或通过邮寄。 将采集卡和送检单一同放入大信封。邮寄前再次核对送检单与样品是否相符。 DBS的质量控制 未采血的滤片应放置在干燥处保存，滤纸表面必须保持清洁，不能与手、奶、消毒液、清洁剂、水等物质接触防止污染。 滴在采血圈内的血液，必须从正面吸入并渗透到滤纸背面。正反面的血斑直径要求一致。避免正反两面滴血及采集有大量组织液的血液或凝固的血液。避免血斑血量不足，渗透不够，而出现梅花状、夹心状和直径＜8mm血斑。 DBS的质量控制 合格血斑的六条标准是 ①每个血斑直径要达到10mm； ②同时取3个血斑； ③血液必须完全渗透到滤纸背面； ④无重叠； ⑤无污染； ⑥易洗脱。 采集好的血斑标本应按要求保存，避免因保存不当造成血标本固化于滤纸上，检测时被测物洗脱不下或部分洗脱，出现假阴性结果而漏诊。 DBS在HIV检测中的应用 以下数据引自中国CDC性艾中心网页。 1、HIV抗体检测 2、HIV-1前病毒DNA检测， 3、HIV-1基因序列测定和亚型分析 HIV抗体检测： 相同血样的滤纸片干血斑样本与血浆样本用EIA法检测，符合率为100%，相关性为0.919。 两种样本经WB确认，条带完全一致的占总数的42.85%,其中主要条带（至少有2条env带出现，或至少1条env和p24带同时出现）的符合率为100% DBS在HIV检测中的应用 HIV-1前病毒DNA检测： 采集了59例静脉吸毒HIV-1感染者的DBS血样和22例HIV-1阴性健康人EDTA抗凝静脉全血5ml，保存全血1ml，另用50μl制备干血斑样本后，分离血浆。 结果发现，59份DBS样本HIV-1 感染基因诊断敏感度93% ；22份全血样本94%，χ2检验显示，两种样本用于HIV-1 基因诊断时无统计学显著性差异。 22份两种阴性样本特异性均为100%。 18对全血和DBS样本HIV-1基因诊断一致性分析，符合率94%。 DBS在HIV检测中的应用 HIV-1基因序列测定和亚型分析： 研究采集了20例静脉吸毒HIV-1感染者的EDTA抗凝静脉全血2ml， 50μl制备干血斑样本。 结果发现，干血斑样本与全血样本DNA PCR产物亚型分析一致，氨基酸序列比对同义和非同义替换比例、位置和类型基本一致。 DBS在HIV检测中的应用 婴幼儿早期诊断 新发感染的检测 病毒载量检测 耐药性分析 能力验证（PT） Thang you! 问问邓老师的看法。。。。采血部位进行按摩或者热敷。 我刚开始采集这类标本的时候也是比较不够标准的，当然现在也在在改善中。有些时候是采不够的，于是在第一滴血上在加一滴，整个血斑就不完整。现在我每次采血之前都跟