生物化学王镜岩第三版第八章蛋白质理化性质课件精要.ppt

（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 + — 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。 - + 等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － O’Farrell的蛋白质双向电泳 银染结果 考马斯亮染色为蓝色 O’Farrell的蛋白质双向电泳 什么是层析-chromatography 蛋白质分离纯化中常用的层析 分子筛层析 亲和层析 离子交换层析 疏水/反相层析 物理吸附层析 层析的种类 利用分子量差异 利用电荷差异 利用亲疏性差异 利用特异性亲和 利用非特异性吸附 分子筛层析的工作原理 分子筛层析的工作原理 分子筛层析，Molecular-sieve chromatography; 凝胶过滤: Gel filtration chromato-graphy; 或 Gel retar-dation chromatography. /v/b1605129293.html /u/vw离子交换层析原理 离子交换层析的原理 离子交换层析的洗脱过程示意 离子交换层析的洗脱 蛋白质定性定量分析 蛋白质分子量的确定方法 蛋白质分子量的确定方法 超离心法: Mr=RTs/[(1-υρ)D] 凝胶过滤: lgMr=a/b-(1/b)( ve/ v0) SDS－PAGE法: lgMr=a-bμR 扩散法: 渗透压法: Mr=RT/limπ/c 根据化学组成： 最低相对分子量=（元素的原子量/某元素的百分含量）*100 复旦大学生物化学系 黄伟达 蛋白质的定量法 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。 蛋白质的定量法 复旦大学生物化学系 黄伟达 蛋白质的定量法 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 甘氨酸的消化过程可表示如下： CH2NH2COOH+3H2SO4一2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4一(NH4)2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。 蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 蛋白质分子中的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在540nm波长有特定吸收峰，所产生的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，依此原理可测蛋白质含量。由于此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用生成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应。 蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 　　此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨