生物技术制药课件第一二章精要.ppt

（三）导入途径 导入途径有：转化、转染、感染，还可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。 这些途径将随载体种类和受体系统的不同而异。 1、转化：将携带目的基因的重组质粒导入受体细胞的过程称为转化。 2、转染：将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞的过程称为转染。 3、感染：将重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再导入受体细胞的过程。 （四）重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞的转化 重组质粒DNA转化到大肠杆菌细胞中的效率与其“感受态”有关。 感受态就是细菌吸收转化因子（重组质粒DNA）的生理状态； 有两种途径可以得到大肠杆菌感受态细胞： 1、一是直接向供应商购买冻存的感受态细胞，这些产品非常可靠但价格昂贵。 2、二是在实验室自行制备感受态细胞。 （1）用氯化钙制备新鲜感受态细胞及重组质粒DNA的转化 该法适用于大多数大肠杆菌菌株，具有简单快速、重复性好的优点。 制备方法：将大肠杆菌某受体菌株的单菌落接种于液体培养基，经振荡培养后，在低温（冰浴）下离心洗涤，加入冰预冷的0.1Mol/L CaCl2溶液重悬细胞，进行感受态处理。 转化过程：处于低温下的感受态细胞CaCl2悬浮液，加入微量（10μl）的重组质粒DNA，轻轻混匀后，置冰浴中30min，再放入42℃水浴中静置1.5min，立即移至冰浴中冷却1~2min。 最后，转化的细胞进行复苏培养和选择性培养，在平板上长出转化细胞的菌落。 （2）用复合剂制备新鲜或冷冻的感受态细胞及重组质粒DNA的转化 该方法较复杂，只有在需要很高转化率的少数情况下才考虑采用。大多数情况下采用第一种较简单的方法已可满足要求。 该方法是将大肠杆菌受体菌株细胞悬浮于组合的二价阳离子（MnCl2和CaCl2）中较长时间，并用二甲基亚砜（DMSO），二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴等复合试剂处理细胞，可使其转化率提高100~1000倍。 3、高压电穿孔转化法 该法既可用于将DNA导入真核细胞，也可用于转化细菌。 通过优化各个参数（电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等），每1μg重组DNA可得到109~1010个转化细胞，是用化学方法制备感受态细胞转化率的10~20倍。 当电场强度和电脉冲长度以一定方式组合而使细胞死亡率在50~75%时，其转化率可达到最高。 具体过程如下： ①将培养至对数中期的细胞加以冷却、离心，用低盐缓冲液洗涤并回收细胞。 ②用10%甘油重悬细胞（使浓度为3×1010细胞/ml），在干冰上速冻后置于–70℃贮存（有效期6个月以上）。 ③电转化：将融解后的细胞悬液与重组质粒DNA混合（20~40μl），移入一个预冷的样品槽内，于0~4℃下用较高的电场强度进行转化。 高压微小电极和样品槽可向厂商购买。 （五）重组λ噬菌体DNA的体外包装与感染 重组λ噬菌体DNA经体外包装到噬菌头部成为有感染力的噬菌体颗粒，在以此噬菌体为运载体感染受体细胞。 1、方法原理 用λ噬菌体的突变株感染适当的菌株，再从感染的细胞中提取包装所用的组分。 再用此提取物对重组噬菌体DNA进行体外包装，有0.05~0.5%的重组噬菌体DNA可被体外包装成有感染力的噬菌体颗粒。每μg重组λ噬菌体DNA可获得108个噬菌体颗粒。 2、来源 （1）目前厂商已有优质高效的包装提取物产品供应，除非所需包装提取物的量很大时才自行制备。 （2）自行制备：用于制备包装提取物的溶源性大肠杆菌菌株母液应在甘油中贮存于-70℃，需要时直接用贮存母液进行接种培养。 ①先将溶源菌在32℃培养至对数中期，将培养温度提高到45℃并持续15min，以灭活CI组抑物并诱导裂解功能。 ②再将细菌于38~39℃培养2~3h，使包装蛋白逐渐积累，然后制备细菌包装提取物。 作业： 1、目的基因DNA与载体DNA体外重组的定向克隆法和粘性末端连接法各有何特点？如何克服酶切后同一DNA片段自身环化？ 2、目的基因DNA与载体DNA体外重组的平端连接法所用的合成街头和衔接头各有何特点？ 3、解释：转化，转染，感染。 4、理想受体细胞应具有哪些特性？ 5、简述制备感受态细胞的基本方法。 四、含目的基因重组细胞株的筛选与鉴定 重组体（细胞株）筛选问题的提出。 从通过转化或感染获得的细胞群体中筛选出含目的基因的重组细胞株，这是基因工程操作中一项十分重要的工作。 ①由于限制酶的酶切片段是大小不一的混合物，连接的产物除了带目的基因的重组载体DNA外，还混杂有其它类型的重组载体DNA。 ②在转化或转染的细胞群体中还有仅是载体DNA或外源DNA片段导入而成的细胞株。 因此，必须从细胞群体中分离筛选出带有目的基因的重组细胞株。 （1）定向克隆法 当用两种不同的限制酶（如用BamHⅠ和HindⅢ）消化同一DNA基因组时，切下来的同一DNA片段