生物技术基因工程篇精要.ppt

1、限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法） 4、通过PCR把目的基因扩增出来 * （2）M13噬菌体（M13 phage） 特点： 单链线性DNA分子 大肠杆菌被感染后，并不死亡，只是生长缓慢，而新的噬菌体被释放到菌体外。 感染大肠杆菌后，单链线性DNA分子可转变成双链复制型(RF)。从大肠杆菌中分离出双链复制型的M13还可作为克隆双链DNA的载体 具非必需区(IS) 从宿主菌体中释放出来的M13噬菌体粒子只含单链DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中两条中的一条，因此可用来制备单链DNA探针，也可以用作DNA测序的模板。 筛选：蓝白筛选 ◇是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。 ◇ 由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。 ◇在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。 （3）粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒/粘粒/cos质粒 cosmid的构造特点: ◇含有抗药标志和复制起始部位； ◇一个或多个单一酶的限制位点； ◇带有入噬菌体粘性末端； ◇分子小，可容纳大的外源DNA片段。 将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列（ARS）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞 YAC。 （1）酵母为宿主的载体 3、真核细胞为宿主的克隆载体 人工构建的酵母质粒 酵母人工微小染色体（YAC） （2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体 Ti质粒 （3）DNA病毒载体 1）SV40载体（猴肾病毒） 完整的SV40载体 利用SV40元件组建的穿梭质粒载体， 如pSVK3质粒： 由 噬菌体 三种载体构建而成 质粒 SV40 2）乳头瘤病毒载体 如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。 3）腺病毒载体 如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。 克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。 表达载体(expression vector) 在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。 启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号 大肠杆菌表达载体 除克隆载体的特性外还含有： 哺乳动物表达载体 除含有原核序列（在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因）还包括：启动子/增强子、克隆位点、终止信号和加poly（A）信号。 三、目标基因与载体DNA连接形成重组体 工具酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease ) ◇能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷酸酯键，切断分子。 ◇ 识别序列的特点 ①专一；②常由4~6个碱基组成； ③具有回文序列 BamH 1 酶-GGATCC- -CCTAGG- ◇ 限制性内切酶都是从原核生物中发现的。到目前为止已发现上千种限制性内切酶，其中数十种被经常使用。 ◇ 水解磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3 ′端为—OH 限制酶的命名 EcoR Ⅰ 细菌的属名 从该细菌中分离出的第几个酶 细菌种名 细菌株系 切口类型：（1）形成粘末端(cohesive end)： 目的基因 　　连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 （2）形成平末端 SmaⅠCCC↓GGG GGG↑CCC DNA连接酶(DNA ligase ) 四、重组DNA导入受体细胞 转化（transformation） 以质粒为载体，将携带外源基因进入受体细胞的过程。 转染（transfection） 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程。 受体细胞大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞 ※受体细胞必须是限制性内切酶缺陷型，即R-菌株，使载体或重组DNA不被水解 受体细胞大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞细菌细胞作为表达系统 优点： 操作简单、增代时间短、价格低廉； 某些蛋白质的表达水平很高 缺点: 表达多肽分子常不能适当地