aβ3-10疫免疫对3月龄ad转基因模型鼠appsweps1的预防保护研究.pdf

·中文论著摘要· Ap3—10疫苗免疫对3月龄AD转基因模型鼠 APPSWE／PSl的预防保护研究 目 的 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年人常见的神经系统变性疾病， 主要临床表现为进行性记忆障碍和智能减退。本病的主要病理特点为老年斑、神 经原纤维缠结和神经元丢失。越来越多的证据表明，D淀粉样蛋白 构成老年斑的主要成分。目前治疗主要是对症为主，尚无有效的治疗手段。在分 子生物学迅速发展的基础上开始形成了一种新的疗法一基因免疫法。基因免疫治 疗是通过基因编码的蛋白在动物自身的表达诱导免疫反应，产生对抗疾病有关的 特异性蛋白的方法，具有高度的特异性和可选择性特点。己通过动物模型和人体 实验研究表明，基因疫苗可以减少或清除913。我们实验选用AD3．10片段重组构 行免疫治疗，观察其行为学改善，可以形成抗A肛2特异性抗体，减轻Ap沉积及 时没有脑内炎症反应发生，在重要脏器中无病理改变，说明该疫苗的安全性。本 实验证明该疫苗是一种安全有效疫苗，为进一步的临床试验治疗提供了参考依据。 材料与方法 B 用PCR扩增A3—10片段lO次，克隆CpG序列插入上述片段，从而获得目的 f 基因AB(3—10)10-CpG，再把A 2、动物分组与免疫方法 B卜42组(n=5)和AD3—10组(n=5)。A13 组：对照组(n=5)、A 3-10组在接种前一 天用布比卡因处理，首次分别取AB卜42疫苗、AB3一i0疫苗及PBS液100 ug／ 只，肌肉注射相应组鼠左侧股四头肌，2周后予加强接种1次，以后每4周加强 接种1次，共进行9个月。 3、空间学习记忆能力检测 最后1次接种后l周用Morris水迷宫检查鼠空间学习记忆能力，前4天定位 航行测试的8个Block的训练，实验观察和记录鼠寻找并爬上平台的路线图及所 需时间，即记录其逃避潜伏期和游泳速度。空间探索用于测量学会寻找平台后， 对平台空间位置记忆的保持能力。记录目标象限的游泳距离占总游泳距离的百分 比，判断其学习和记忆的能力。排除游泳速度所致的差距。 4、鼠处死取标本 每次免疫后2周取血，分装一70℃冻存。在109／L戊巴比妥钠腹腔麻醉下， 从左心室快速灌注生理盐水100ml，迅速分离脑、脾脏、肝脏、肺脏和两侧肾脏， 称其湿重量，脑组织匀浆，脾细胞增殖培养，余标本409／L多聚甲醛固定。用ELISA 检测抗体水平及IFN—Y、IL-10，酶标仪测各孔值并计算分析。 5、Western B(3．10) Blot检测重组质粒载体pcDNA3．1+—-A 10．CpG构建及体外表达 蛋白提取后，取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳，经一抗、二抗孵育并显色， 照像及分析。 ． 6、免疫组织化学染色观察淀粉斑的沉积 石蜡切片常规二甲苯脱蜡梯度酒精水化，分别加入一抗、二抗孵育染色，显 色染色切片镜下照像并分析。 7、HE染色观察重要脏器的改变 石腊包埋切片，常规HE染色，肾组织块六胺银染色(MSSG)观察基底膜。光 镜下观察并照像。’ 2 8、统计学分析 所有原始数据采用SPSSl 1．0分析软件进行处理分析，所有结果均表示为均数 ±标准差，样本均数比较采用单因素方差分析方法，正态分布及方差齐时，两两 比较用LSD检验；非正态分布采用秩和检验，PO．05有显著性差异。 实验结果 1、Morris水迷宫