cik细胞的体外抗肿瘤作用及回输后体内分布特点研究.pdf

中文摘要 CIK细胞的体内外抗肿瘤作用及回输后体内分布 特点研究 摘 要 目的：采用人宫颈癌细胞模型为研究对象。研究细胞因 killer cells，CIK细胞) 子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced 对人宫颈癌细胞及该细胞荷瘤小鼠的体内外抗肿瘤作用。分 析将体外培养的CIK细胞回输体内后在不同组织器官的分布 特点，为CIK细胞临床应用提供理论依据。 方法： 1 CIK细胞的制备及扩增采集健康志愿者外周血，经 bloodmononuclear 0c，每3 IL．2、抗CD3单抗和IL．1d更换新鲜无血清培养基 并补充IL．2，每7d测定细胞增殖反应，并绘制细胞生长曲 线。经14d培养后收集CIK细胞。 2CIK细胞表型及产生细胞因子测定用流式细胞技术 检测CIK细胞表型分子的表达。用半定量RT-PCR法检测体 外培养O、7、14、2l、28、35 表达变化。 3CIK细胞的杀伤活性测定收集PBMC、体外经细胞 作为靶细胞，以效靶比为20：l和40：1将两种细胞混合培养 48 中文摘要 胞的杀伤作用。 4经瑞氏一姬姆萨染色后，用光学显微镜观察CIK细胞 对Hela．1uc细胞作用后的细胞形态变化。 5荷瘤小鼠模型的建立 收集呈对数生长期的Hela．1uc 细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×108／ml，于BALB／c 裸鼠右侧胸背部皮下注射细胞悬液0．1ml，ixl07／只，建立 荷瘤小鼠模型。 6CIK细胞的体内抑瘤作用向裸鼠移植肿瘤细胞7d 后，于荷瘤小鼠的瘤旁分别注射CIK细胞(实验组)或PBS (对照组)，每组6只。通过精诺真体内成像系统动态观察 肿瘤大小变化及治疗效果。治疗结束后收集小鼠外周血、肿 瘤组织、肺、肝、脾组织。 7用ELISA法检测荷瘤小鼠外周血中IFN-T的水平。 8经HE染色，显微镜下观察肺、肝、脾的组织病理学 变化以及有无肿瘤细胞浸润。 9用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记 CIK细胞，经激光共聚焦显微镜观察标记情况。 10 通过腹腔、瘤 CIK细胞在荷瘤小鼠体内的分布检测 旁分别给荷瘤小鼠注射经CFSE标记的CIK细胞，对照组不 h留 进行任何处理。分别于注射CIK细胞后3、6、12、24 取外周血、肿瘤组织、肺、肝、脾。将上述各待测组织剪碎， 制成单细胞悬液，一部分经流式细胞技术检测各组织中 CFSE标记的CIK细胞含量；另一部分进行激光共聚焦显微 镜观察肿瘤组织中CIK细胞的分布情况。 结果： l将人外周血单个核细胞经不同细胞因子体外培养后， 中文摘要 d 诱导分化的CIK细胞在培养至第7d时开始快速增殖，14 时达高峰，增殖倍数最高达100倍以上。 细胞的百分率均大幅度增加，14d时的表达率分别为92％、 天相比(1．10％)增加57．5倍。 mRNA表达 3体外诱导培养不同时间的CIK细胞IFN-f 水平不断增加，在14d时达到高峰。 4以20：1、40：1的比例将效、靶细胞作用48h后，CIK 为(16．33-4-3．09)％和(21．26士2．71)％。 5经瑞氏．姬姆萨染色显微镜下可见：正常靶细胞呈菱形 或多边形生长，形态饱满，细胞核染色均匀；与CIK细胞共 培养的靶细胞周围有多个效应细胞围绕，形成花环状，靶细 胞膜