cxcr4基因默和sdf-1α对骨髓间质干细胞脑内迁移的影响.pdf

摘要 CXCR4基因沉默和SDF．1Q对骨髓间质干细胞脑内迁移的影响 博士生：陈东平 专业：神经病学 导师：张志坚 缺血性脑卒中是中老年人致死致残的主要疾病之一，目前尚无有效药物能够阻止脑 缺血和再灌注损伤引起的多重神经损害。许多动物实验表明，骨髓间质干细胞(MSCs) 经全身或局部移植后能促进卒中后神经功能的修复。在大鼠脑卒中和创伤模型中，经静 脉或大脑内直接注射MSCs后，MSCs可穿过血脑屏障向损伤脑组织聚集，进而修复神经 功能。其中，损伤组织似乎可特异吸引MSCs向损伤区迁移，然而，目前对调节MSCs 迁移进而向损伤脑组织聚集的机制还不清楚。 血心肌的定向迁移、聚集中起很重要作用。而SDF．1们XCR4在低氧条件下表达增加， 织的定向迁移中可能也起很重要作用。 RNA干扰(I斟处)技术可稳定沉默哺乳动物细胞内的靶向基因，是研究基因功能的 RNAi 强大工具。为探讨脑缺血损伤中MSCs的迁移和调节机制，我们首先构建CXCR4 实验研究CXCR4基因沉默和SDF．1Q对rMSCs迁移的影响。本课题分三部分。 第一部分：CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定 1、材料和方法 1) 根据大鼠CXCR4mRNA序列，选择三个2Ints的靶序列，设计并合成包含各正、 反义靶序列的互补DNA链； 2)退火后插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面，产生pRiCXCR4a,b，c； 3)酶切电泳和测序鉴定； 4)质粒鉴定正确后，将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切，插入到慢病毒载体 质粒pNL中，产生pNL．RiCXCR4a,b，c。 2 2、结果 1)酶切鉴定和测序都证实pRiCXCR4质粒构建正确。+ 2)将pRiCXCR4中的CXCR4shRNA表达结构插入pNL质粒，产生能同时表达增 强型绿色荧光蛋白(EGFP)和转录产生CXCR4shRNA的慢病毒载体质粒，测 序鉴定正确。 3、结论 1)成功构建大鼠CXCR4 shRNA表达载体pRiCXCR4。 2)成功构建大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体pNL．RiCXCR4。 3)为通过阻断大鼠CXCR4基因表达进而研究CXCR4功能奠定了基础。 第二部分：CXCR4基因沉默的骨髓间质干细胞的构建、培养与鉴定 1、材料和方法 病毒； 2)经超速离心收集病毒颗粒，转导293T细胞，用流式细胞术测定EGFP蛋白表达 率来测定慢病毒功能滴度； rMSCs／pNL-RiCXCR4(MSC．CXCR4)： 4)用实时定量RT-PCR、WesternBlot和流式细胞术检测CXCR4mRNA、蛋白质和 细胞表面表达水平，筛选有效的CXCR4基因沉默的细胞系MSC．CXCIⅥ； 本细胞的生长变化。 2、结果 毒。 2)未浓缩含病毒细胞培养上清和浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6．4x104TU／mL 和6．9x106TU／mL。 3)CXCR4基因稳定沉默细胞MSC．CXCR4强烈表达EGFP。 4)实时定量RT-PCR、Western CXCR4抑制作用最显著。 3 5)亲本细胞、非特异细胞和CXCR4基因沉默细胞的生长曲线和倍增时间无明显差 异。 3、结论 1)包装产生高滴度慢病毒，并能高效转导rMSCs。 2)建立CXCR4基因稳定沉默细胞系MSC．CXCR4。 mRNA、Western 3) 实时定量RT-PCR分析CXCR4 Blot检测CXCR4蛋白和流式细 CXCR4基因表达显著下调。 4)细胞生长曲线测定实验证明，CXCR4基因沉默rM