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Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究 中文摘要 Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究 中文摘要 目的 前列腺癌在接受内分泌治疗2年左右，约50％的患者出现激素抵抗，进 展为去势治疗失败前列腺癌(CRPC)。即使在CRPC状态下，雄激素受体(AR) 作为转录因子仍然持续激活下游基因的转录，产生PSA。通过雄激素受体反 应元件陷阱核酸(ARE DNA)在LNCaP细胞中作用，阻断AR激活， decoy 研究其对下游信号通路的影响。 方法 根据根据目前已知的位于PSA基因启动子．170附近的ARE．I序列 代修饰，同时双侧末端标记生物素或FITC。对照组核酸两端分别标记生物素 核酸与LNCaP细胞核蛋白提取物特异性结合能力，模拟其与雄激素受体(A鼬 特异性结合情况。根据实验结果选取与核蛋白特异性结合最强的decoy核酸， 细胞增殖能力；使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞的形态学改变；通过提 取转染后细胞内DNA，行水平电泳检查有无凋亡改变；通过western．blot检 测转染后细胞内蛋白表达情况及信号通路改变。 结果 decoy核酸相对于部分硫代修饰的ARE．I、ARE．IIdecoy核酸以及对照核酸， 与LNCaP细胞核蛋白特异性结合能力更强，且探针浓度越高与核蛋白结合能 力越强。完全硫代修饰后decoy核酸稳定性强于部分硫代修饰。 修饰后decoy核酸转染入LNCaP细胞，转染率约为30％。转染24．72小时后， 使用MTS法检测细胞增殖活性发现，完全硫代修饰的ARE—II deoy相对于对 照组核酸对LNCaP细胞增殖抑制效果最强(P小于O．01)，在转染后48小时， Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究 中文摘要 完全硫代修饰的ARE．IIdecoy核酸对LNCaP细胞的增殖抑制作用达到最强， 到72小时后抑制作用逐渐减弱。 3．细胞形态学观察：使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞形态学改变， 发现转染完全硫代ARE．II 蓝色，细胞核内见绿色的荧光小点，为FITC标记的完全硫代ARE．II decoy 核酸，表明decoy核酸已转染进入细胞核内发挥作用，转染率为30％。转染 后的细胞相对转染前，细胞数明显减少，细胞膜隆起，胞核明显皱缩，出现 核染色质分块，呈现凋亡改变。 4．DNA水平检测：提取转染完全硫代ARE．II decoy组，转染对照核酸组， 以及正常LNCaP细胞内DNA，水平电泳发现转染完全硫代ARE．II decoy组， 出现阶梯状的DNAladder，表明转染后细胞发生凋亡改变，而对照组与空白 组未出现上述改变。 没有明显变化，但转染完全硫代ARE．II decoy后细胞内的p-Akt表达明显降 低，Akt信号通路被抑制，促进了细胞凋亡过程，同时转染后细胞内的PSA 蛋白表达水平也较未转染前明显下降。 结论 完全硫代修饰的ARE．II decoy核酸与雄激素受体结合能力最强，且 完全硫代修饰的decoy核酸比部分硫代修饰的decoy核酸稳定性更强。转染 完全硫代修饰的ARE．II decoy核酸明显抑制LNCaP细胞的生长，促进细胞 凋亡，抑制了细胞p-Akt蛋白的表达，使细胞内PSA蛋白水平明显下降，改 变了细胞内信号通路。decoy核酸