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ephrina在脂多糖处理后星形胶质细胞增殖中的表达及其机制研究
摘要
手两 斐
背景
中枢神经系统损伤后无法恢复原有功能的主要原因是轴突再生障碍,轴突
再生困难一方面是由于缺乏轴突生长和导向的生长促进因子,另一方面是细胞
微环境的抑制性改变,最近的研究表明轴突导向分子也参与成年轴突再生。Eph
受体酪氨酸激酶家族及其配体ephrins是一种重要的轴突导向分子家族,参与神经
系统生长发育期的轴突导向,其在成年中枢神经系统中继续表达,通常维持在
低水平,但当神经系统损伤如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞活化时出
现上调,表达上调直接抑制轴突再生,另外,Ephs和ephrins还可以调控胶质增生
和胶质疤痕的形成,也可影响成年神经干细胞的增殖、分化和迁移,所以
Eph/ephrin信号系统不止通过一种机制影响中枢神经系统再生和功能恢复,而调
节Ephs和ephrins表达及其信号系统对成年中枢神经系统损伤后再生至关重要,通
过对ephrin/Eph的调控,可能对脑卒中等中枢神经系统疾病的治疗和康复产生重
要影响。中枢神经系统损伤或发生神经退行性疾病后,炎症反应非常明显,星
形胶质细胞显著激活,产生一系列炎性因子、趋化因子和营养因子等,在神经
元的发育和存活、轴突的再生、神经干细胞的分化等过程中发挥重要作用。研
和ephrins表达有关。EphA4广泛分布在大脑神经元上,多种研究表明其在中枢神
经系损伤修复中起负向调节作用,ephrinA3是Eph受体的配体之一,存在于星形
实验就是基于上述研究用脂多糖建立炎症模型,观察脂多糖对星形胶质细胞的
影响,探讨炎症损伤后的ephrinA3的变化以及这种变化与炎症反应的关系。
目的
1.分离、培养和纯化大鼠大脑皮层星形胶质细胞。
2.探讨脂多糖对体外培养的星形胶质细胞增殖的影响和ephrinA3在其中的
表达变化及其可能机制。
方法
1.选择出生在24h以内的新生Wistar大鼠为实验动物,分离、培养其大脑
皮层星形胶质细胞并纯化。
摘要
2.倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的生长情况和形态变化。
3.应用免疫组织化学染色鉴定星形胶质细胞特异性标志物GFAP表达和
ephrinA3在星形胶质细胞上的表达,并对第三代星形胶质细胞进行纯度测定。
4.取第三代细胞用于实验,随机分为对照组和实验组,实验组用脂多糖
72h干预组。
5.MTT法测定各组星形胶质细胞的存活率。
6.AO/EB荧光染色检测各组星形胶质细胞的凋亡率。
7.CY3荧光染色测定各组星形胶质细胞上GFAP和印晡hA3的表达。
8.ELISA法检测各组星形胶质细胞培养液中TNF.仅和IL.6的含量。
9.用SPSSl3.0统计软件分析所得数据,所有数据均以均数-I-标准差(x士s)
表示,经方差齐性检验后,多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间
异有统计学意义。
结果
1.倒置相差显微镜下可见随着培养时间的延长,星形胶质细胞胞体逐渐增
大,突起逐渐变长,形态变得逐渐分明,经纯化培养后,星形胶质细胞形态逐
渐变得单一,呈梭形或星形,胞体明显,境界清楚。脂多糖干预组较未干预组
的星形胶质细胞胞体大,突起长。
2.传至第3代时,用抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行纯度鉴定,结
果显示星形胶质细胞纯度可达97%以上,并用ephrinA3多克隆抗体鉴定星形胶质
细胞上的ephrinA3表达,可见阳性表达。
3.MTT法测定各组星形胶质细胞的存活率发现:脂多糖(10mg/L)作用
于星形胶质细胞6h、24h、48h和72h的细胞存活率均提高,与对照组相比均有
显著性差异(P0.05),而30min组细胞存活率与对照组相比无显著性差异
(P0.05)。
4.AO/EB荧光染色检测各组星形胶质细胞的凋亡率发现:脂多糖(10mg/L)
作用星形胶质细胞6h、2411、48h和72h的细胞凋亡率均下降,与对照组相比均
有显著性差异(氏O.05),而30min组细胞存活率与对照组相比无显著性差异
II
摘要
(P0.05)。
5.
发现:荧光显微镜下观察发现,各组星形胶质细胞的胞体和突起均呈红色荧光,
细胞核不显色,为一暗区。脂多糖作用24h、48h和72h的胞体和突起的GFAP
6.
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