her2-scv导向的rnai对her-2阳性乳腺癌治疗的研究.pdf

中山大学附属第二医院乳腺外科 专 业： 外科学 博士研究生： 姚燕丹 导 师： 宋尔卫教授 摘 要 研究背景和目的： 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率已跃居女性恶性肿瘤第一 位，为女性的“第一杀手。随着对乳腺癌研究的逐渐深入，发现不同的乳腺癌 可能有不同的基因表型，而这些基因表型往往表现在对治疗的反应有很大差异。 如Her2就是乳腺癌典型的恶性基因表型之一，在乳腺癌中过度表达，与癌细胞 的增殖、转移和化疗耐药呈正相关。 目前针对Her2的主要方法有抗Her-2单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂和反 义基因技术等，但均不能阻止新的HER-2蛋白的生成，而且还有严重的毒副反 应，使临床应用受到很大限制。 因此，开发新的高效低毒的靶向HER-2治疗方法已成为当务之急。我们设 针对肿瘤恶性基因表型PLKl的特异siRNA药物的治疗方法。 本研究目标： 1．设计并筛选出能浓缩和结合siRNA的多肽，与抗Her2．ScFv合成融合蛋 白，并在昆虫细胞杆状病毒表达系统中优化表达和纯化出具有良好结合 能力和靶向活性的融合蛋白。 2．在体外乳腺癌细胞培养中检测F5．P融合蛋白携带siRNA对Her2阳性乳 腺癌细胞的导向能力、基因沉默作用和抗肿瘤效应。 3．通过乳腺癌细胞株裸鼠体内的种植模型检验抗Her2．ScFv与多肽融合蛋 白导向RNAi的能力和基因沉默作用，并观察其抗肿瘤效应。 研究方法： 构建用于表达F5．P融合蛋白的质粒后，通过昆虫细胞杆状病毒表达系统进 shift 行转染、表达、纯化和鉴定融合蛋白。随后用动态光散射和Gel assay方法 评价F5．P融合蛋白与核酸物质结合的能力。 在体外用流式细胞检测技术和共聚焦显微镜技术评价F5．P融合蛋白能否把 荧光标记的siRNA输送到Her2阳性的乳腺癌细胞；随后在体内用小动物成像系 统和肿瘤冰冻切片评价F5．P融合蛋白把荧光标记的siRNA输送到体内后在肿瘤 区域的分布。 Western time blot和RealPCR评价靶基因的mRNA和蛋白的表达水平；接着用 3H胸腺嘧啶核苷、MTT、球囊形成能力和多种检测凋亡的方法评价F5．P融合蛋 白靶向输送siRNA治疗后对增殖的抑制和对凋亡的诱导作用。 性乳腺癌原位移植模型和转移模型，并测量和绘制肿瘤生长曲线和生存曲线、肿 timePCR等进 瘤组织切片免疫组化增殖和凋亡染色以及小动物成像系统和Real 行疗效综合评价。 研究结果： mM的条件下洗脱时所获得的融 达系统进行表达；检测显示在咪唑浓度为250 合蛋白纯度较高。 shift 2．动态光散射和Gel assay检测显示融合蛋白能够与核酸物质结合，而且结 合siRNA后颗粒大小没有明显的改变。 3．用流式细胞检测技术和共聚焦显微镜技术检测显示F5．P融合蛋白能够把 FAM．siRNA输送到Her2阳性的乳腺癌细胞内。小动物成像系统和肿瘤冰冻 瘤。 Ⅱ 和蛋白表达水平的下降，细胞增殖和克隆形成能力明显受到抑制，而且出现 明显的细胞周期阻滞和细胞凋亡。 ． 5．经F5．P融合蛋白和siRNA进行体内靶向治疗，显示乳腺癌原位移植瘤的生长 受到明显抑制，而且乳腺癌的转移明显减少和裸鼠生存期延长。 结论 1．通过昆虫细胞杆状病毒表达系统进行表达，可以获得纯度较高并具有良好结 合核酸物质活性的F5．P融合蛋白。 2．F5．P融合蛋白能靶向输送siRNA到目标细胞，并下调靶基因mR_NA和蛋白 的表达，从而产生抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的效应。