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·中文论著摘要· RNA干扰沉默Smad3基因对百草枯致小鼠 肺间质纤维化的保护作用 刖 吾 百草枯(paraquat，PQ)，又称克无踪、对草快，属于有机杂环类接触性脱叶 剂及除草剂。化学名称是1，1，一二甲基-4，4．’联毗啶，分子式为C12H14N22C1。自 1962年起，百草枯作为除草剂应用于农业并得到迅速推广，目前在中国农村应用 非常广泛。但人和动物摄入百草枯后，会表现出强烈的毒性。我国常可见到百草 枯中毒病例，即使食入少量百草枯，也表现出极高死亡率，个别报道高达80％以 上。 百草枯可引起多脏器损伤，但以肺损伤最为突出。肺损伤表现为肺水肿、炎 症细胞浸润、肺泡出血、成纤维细胞增生和胶原沉积。百草枯中毒患者临床表现 分为两个阶段：早期患者在中毒数天内死于急性呼吸窘迫综合征和多脏器功能衰 竭。大多数早期存活下来的患者将逐渐出现不可逆的肺间质纤维化并在数周内死 亡。个别幸存的病人由于存在肺间质纤维化，也严重影响其生存质量。 growth 转化生子因子-pl(Transforming 基质改变，在各种类型的肺间质纤维化中都具有重要的作用，被称为纤维化进程 的“开关因子”。在百草枯中毒的早期，就可检测到TGF．plmRNA和蛋白表达增强。 近几年的研究表明，TGF．Bl信号是通过I、Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸激酶受体进行传导。 激活的I受体磷酸化下游的信号分子，受体激活型的Smads蛋白(Smad2和 引起纤维化相关的改变。其中，Smad3基因的表达在肺纤维化中起重要作用。敲 除Smad3的小鼠对博来霉素诱导的肺间质纤维化表现出极大的抵抗，提示抑制肺 组织中Smad3基因表达对药物性肺纤维化有治疗作用。 RNA干扰(RNA 外特异性的抑制靶基因的表达。RNAi主要通过在转录后水平阻断基因的表达，因 此又称为转录后基因沉默。其作用主要是通过dsRNA被核酸酶切割成21．25nt的 分子实现的。RN加具有高效性和高度特异性等特点。目前发展的载体表达短发夹 RNA(shortRNA，shRNA)，既避免了引起干扰素应答，又允许组织特异 hairpin 性的抑制基因表达，使RNAi更方便进行哺乳动物水平的实验研究和基因水平的 治疗。腺病毒作为基因载体能感染绝大部分细胞，是体外进行基因沉默的有效载 体，对肺组织中的上皮细胞和间质细胞具有很好的转染率。 本实验在百草枯致小鼠肺间质纤维化模型基础上，利用免疫组化的方法，分 析从早期炎症反应阶段和纤维化进展期中TGF．p1和Smad3在肺组织中的表达和 定位。并进一步通过重组腺病毒携带shRNA，沉默百草枯染毒小鼠肺组织中的 Smad3基因，观察其对肺间质纤维化形成的保护作用。 材料和方法 1、免疫组化研究TGF—p1和Smad3在百草枯致肺间质纤维化早期 过程中的表达和定位 (1)百草枯致小鼠肺间质纤维化模型的建立 腹腔注入等量生理盐水。 (2)标本的采集和免疫组化研究 在实验组不同时间点(2、5、7、14d)和对照组(7d)对小鼠进行处理。左 肺叶用4％多聚甲醛固定，用于HE染色。免疫组织化学方法分析不同时间点 TGF．B1和Smad3在肺组织中的表达和定位。 2、沉默小鼠Smad3基因的shRNA筛选和重组腺病毒的构建 (1)shRNA的制备和载体的构建 根据小鼠Smad3mRNA(GenBankAccessionNoNM016769)，编码短发夹转 录序列。委托武汉晶赛生物技术公司编码短发夹RNAs合成进质粒 pGenesill．I+GFP。通过细菌克隆对质粒进行扩增，阳性的克隆被进一步通过测序 2 鉴定。 (2)细胞培养和转染 质粒转染用小鼠L929成纤维细胞。分组为空白对照、负对照、转染 pGenesill．I+GFPSmad3一l、pGenesill．I+GFP Smad3—3 Smad3-2、pGenesill．I+GFP 质粒组。细胞在转染后48和72h进行收集。收集后的细胞用流式细胞仪对阳性克