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siRNA介导的Bmi．1基因沉默对Hela细胞 生物学行为的影响 硕士生姓名：姜 悦 指导教师：孟秀香 教授 专业名称：临床检验诊断学 摘 要 目的：原癌基因Bmi．1属于PcG家族一员，决定着正常干细胞及肿 瘤干细胞的自我更新能力。近年来发现Bmi．1基因在多种肿瘤细胞及恶 性肿瘤中表达上调，并与肿瘤的发生发展预后密切相关，因而有望成为 肿瘤治疗中新的基因靶点和辅助诊断的指标。本研究根据Bmi．1基因设 胞系Hela细胞作为研究对象，通过转染Bmi．1siRNA表达载体进入Hela 细胞来沉默Bmi．1基因的表达，以观察其对Hela细胞生物学行为的影响 并探讨其机制。 方法：l、根据，GENEBANK中的．Bmi．卜mRNA 180， Sequence NM一005 设计四条Bmi．1siRNA序列和一条随机序列的阴性对照，应用NCBI的 网上比对工具BLAST进行查询，确认所设计siRNA序列的唯一性。将 所选择的片段呈反向互补加到茎环序列的两端，加上酶切位点后插入 siRNA的重组真核表达载体。2、采 pGenesil．2质粒，构建了表达Bmi．1 用脂质体法将Bmi．1 细胞中Neo基因的表达，来确定质粒是否转染到Hela细胞中，并利用荧 光法观察转染效率。3、应用RT-PCR及Westernblot方法检测转染后Bmi一1 检测Bmi．1 siRNA对Hela细胞增殖的抑制作用。5、利用流式细胞仪分 析各组细胞的细胞周期。6、平板克隆形成实验检测Bmi．1siRNA对Hela 细胞的单细胞增殖能力的影响。7、在裸鼠腋窝将各组细胞进行皮下接种， 观察在裸鼠体内Bmi．1siRNA对Hela细胞致瘤能力的影响。8、应用 Transwell实验检测Bmi．1 siRNA对Hela细胞体外迁移的影响。9、将各 组细胞从尾静脉注射到裸鼠体内，观察在裸鼠体内Bmi．1siRNA对Hela 细胞转移能力的影响。 结果：l、成功的构建了四条表达Bmi．1siRNA的重组质粒和一条阴 性对照重组质粒。2、转染后观察荧光和Neo基因的表达情况证实重组质 Western blot结果显示：各组Bmi．1 细胞增殖指数明显下降。5、克隆形成实验表明Bmi．1siRNA明显抑制了 siRNA使Hela Hela细胞的单细胞增殖能力。6、体内成瘤实验显示Bmi一1 细胞在裸鼠体内的致瘤能力明显下降。7、Bmi．1siRNA在体外能够抑制 Hela细胞穿过transwell小室的能力即迁移能力。8、Bmi-1siRNA在裸 鼠体内能够抑制Hela细胞的血道转移能力。 胞的增殖和迁移能力，在裸鼠体内抑制了Hela细胞的致瘤及转移能力。 Bmi．1可能与宫颈癌的发生发展、转移和复发密切相关，有望成为～个 新的宫颈癌细胞标志物。 siRNA 关键词：Bmi．1 Hela细胞沉默 2 ofBmi--1 EffectsofsiRNA--mediated silencing gene re nonontthee behaviouellaiourr。‘HeLaOt eLacells expressionDiologicalbiological Master