二丁酰环磷腺苷髓母细胞瘤旁观者效应和化疗药物敏感性影响的研究.pdf

·中文论著摘要· 二丁酰环磷腺苷对髓母细胞瘤旁观者效应和化疗药 物敏感性影响的研究 ．j上．．■一 刖 置 髓母细胞瘤是儿童最常见的恶性脑肿瘤，约占儿童全部脑肿瘤的20％。近年 来虽然通过改良手术技术，放疗及化疗策略在治疗上取得了很大的进步，但患儿 预后仍然不是很理想。髓母细胞瘤目前最主要的治疗方法是手术，配合放化疗。 但由于肿瘤恶性程度高，生长迅速，就诊时往往肿瘤巨大并有脑积水，而且患者 多为年龄较小的儿童，手术风险大。髓母细胞瘤属于对放疗敏感的肿瘤，但肿瘤 细胞易随脑脊液播散，故放射治疗时要做全脑全脊髓放疗，放疗剂量大，对儿童 损伤大。化疗作为一种辅助的手段，对儿童毒、副作用严重。髓母细胞瘤预后极 差。 基因疗法是近年来兴起的新治疗手段，具有非常广阔的前景。然而，由于基 因转染靶细胞效率低等原因，基因治疗目前难以取得很好的疗效。增强“旁观者 “旁观者效应”是指加入前药后，与导入自杀基因的肿瘤细胞相邻近的未导入自 杀基因的肿瘤细胞也被杀死的现象，其明显扩大了自杀基因的杀伤作用。目前许 多报道认为旁观者效应与连接素43(Cx43)和细胞间缝隙连接通讯(GJIC)有关。 cx43是一种主要的细胞间隙连接蛋白，在多种正常组织细胞中表达。Cx43 表达减少或缺失与多种肿瘤的发生、发展及转移相关，特别是与脑胶质瘤的发生、 发展关系极为密切。相邻细胞间通过问隙连接所介导的间隙连接通讯(GJIC)进 行细胞间信息和能量交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化起着重 要的调控作用。在多种肿瘤组织中GJIC功能明显下降。 增加Cx43蛋白表达和GJIC功能能够增强旁观者效应。相对于基因转染，化学 诱导的Cx43蛋白增加可以影响到更多的癌细胞。目前已经发现许多种类的化学药 物诸如类视黄醇、cAMP、类胡萝卜素等都可以增加细胞Cx43的表达量，增强GJIC 功能。另有研究发现将Cx43转染进恶性胶质瘤细胞后，随着Cx43蛋白表达的增加， 细胞对化疗药物的敏感性也增加了。因此，找到某种化学物质能够提高旁观者效 应又能提高细胞对化疗药物的敏感性对于髓母细胞瘤的治疗是非常有意义的。 在本研究中，我们用含有HSv—tk基因的小鼠成纤维细胞株PA317病毒上清转 处理Daov细胞，通过WestemBlot检测Cx43蛋白表达，以划痕标记染料示踪实验 and (scrape．10adingdye vM．26)的敏感性。为探讨机理，又用WestemBlot检测Bcl．2蛋白表达。通过棉子 酚的反向作用探讨了db．cAMP的具体作用机制。 材料与方法 1、人髓母细胞瘤Daoy细胞和PA317细胞的培养 的C02培养箱中培养。一周传代两次。 2、逆转录病毒载体转染Daov细胞 种2纠8h后，收集上清液，滤过后储存于一80℃备用。然后以逆转录病毒载体转 P01ybrene，再加入培养 储存的含有病毒载体的细胞上清液加入终浓度为4肛g／ml G418筛选两周，用间接免疫荧光法检 皿中培养24h。处理后的细胞以150p咖l 测转染效率。G418筛选处理后的细胞，两周后得到稳定细胞株Daov-tk。 3、用间接免疫荧光法检测HSV．tk基因在Daoy细胞中的转染效率。 细胞中。 2 6、用Westemblot法检测Bcl．2蛋白在db．cAMP处理组和未处理组中的变 组：db．cAMP未处理组中的变化。 7、用划痕标记染料示踪实验检测不同处理组细胞的GJIC功能的变化 8、用MTT法检测不同处理组的旁观者效应的变化。 9、用MTT法检测db—cAMP处理组和未处理组中的细胞对替莫唑胺和替尼泊 苷敏感性的变化。 结 果 1、逆转录病毒载体转染Daoy细胞成功，获得稳定的Daoy．tk细胞株。 2、间接免疫荧光实验显示转染含HSV-tk基因逆转录病毒载体于Daoy细胞后， 转染效