人卵巢组织玻璃冷冻及其对印记基因igf-2h19的影响.pdf

◇烹，三●：：=E烹 人卵巢组织玻璃化冷冻及其对印记基因IGF一2／H19的影响中文摘要 博士研究生： 黄丽丽 博士生导师： 杨冬梓教授 研究方向： 生殖内分泌 中山大学附属第二医院妇产科(510120广州) 中文摘要 良、恶性肿瘤的治疗尤其是放、化疗会导致女性卵巢受损而出现月经不规律、 卵巢早衰和不孕。肿瘤治疗前先行将卵巢组织冷冻可以保存大量卵泡，复苏后白体 移植可为卵巢早衰患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性。目前，程序化冷 冻是卵巢组织冷冻常用方法，现已有其冻存的卵巢组织复苏后移植获得健康婴儿的 报道。但是程序化冷冻存在一些难以克服的问题。首先，冷冻和复苏时两次冰晶形 成，增加了损伤的机会，溶液效应(冷冻时，细胞外渗透压高)和渗透性休克(复苏时， 细胞外渗透压低)依然没有彻底解决；其次，对于卵巢这种含有多种细胞、复杂的间 质成分甚至血管系统的组织，采用传统慢速冷冻方法，降温速度和最佳植冰温度很 难同时满足各种细胞成分的需要。而且程序冷冻费时且需要昂贵的程序冷冻仪。玻 璃化冷冻是近年来出现的一种新型冷冻方法，该方法采用高浓度的冷冻剂溶液，将 冷冻对象直接投入液氮中，在急速降温过程中，溶液从液态转化成一种无冰晶的玻 璃化固态，可以最大程度避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留 细胞内外液体正常的分子和离子分布。而且玻璃化冷冻具有操作简便，无需精密仪 器控温等特点。此过程中所使用的载体系统能否达到足以形成玻璃态的降温速度是 决定玻璃化冷冻效果的重要因素。迄今为止，玻璃化冷冻技术中常采用的载体包括 冷冻管、开放式拉长细管、电镜用铜网以及Cryoloop等。但关于人卵巢组织玻璃化 冷冻的报道有限，究竟何种载体和冷冻液更适合人卵巢组织玻璃化冷冻，目前尚无 定论。固相表面玻璃化法是近年新兴的技术，曾成功用于冷冻牛成熟卵母细胞、羊 ◇烹，妻_急曼 人卵巢组织玻璃化冷冻及其对印记基因IGF．2／H19的影响中文摘要 卵母细胞和羊卵巢组织。目前尚未见使用此技术对人卵巢组织冷冻的报道。 本研究首次探讨固相表面玻璃化技术中使用的液氮预冷的固相金属表面和其 它载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果，并在优选载体的基础上，比较不同 浓度冷冻保护剂对卵巢组织的毒性和冷冻效果；同时比较优选的固相表面玻璃化冷 冻方案和传统程序化冷冻方法对人卵巢组织冻存的效果。 近年来，随着辅助生殖技术(ART)的迅速发展，其与表观遗传学的关系日益 受到学者们的重视。基因组印记是表观遗传学修饰的一种，是指哺乳动物控制某一 表型的一对等位基因，根据其亲源不同而差异表达的现象。它不是通过改变基因序 列，而是改变基因转录来调节基因表达。印记基因可以维持相应基因的正常表达模 式，其基因表达产物与性细胞发育成熟、个体生长发育、胚胎和胎盘发育、肿瘤发 生及其它人类遗传病的发生密切相关。所有的印记基因都有一个或几个差异甲基化 区DMR，其内富含CpG位点，这些位点在不同亲本来源DNA的差异甲基化是哺 乳动物产生基因组印记的主要原因。基因印记容易受到周围环境改变的影响，因此 是可以逆转的。印记基因甲基化模式的建立发生在生殖细胞成熟的过程中。在卵母 细胞发育阶段，母源印记逐步建立，只有在排卵前卵泡中的成熟卵母细胞才能建立 完整的印记模式。 使用辅助生殖技术干预卵子、胚胎及卵巢组织的时期正处于母源印记基因形成 的阶段，这些操作可能会干扰印记基因的建立和维持。据报道。d哪出生的婴儿中 BWS、AS综合症或肿瘤如视网膜母细胞瘤的发病有增加趋势。现已证实这些疾病 均与印记基因相关。近年来又有研究表明体外培养卵子或胚胎会引起某些印记基因 甲基化状态发生变化。作为辅助生殖技术之一的卵巢组织冷冻，是将含有大量卵泡 的皮质降温至液氮保存并快速复温的体外操作过程。虽研究已证实该技术可以保存 卵泡的J下常形态和生长能力，但此过程是否会影响卵泡细胞印记基因甲基化程度， 从而改变某些对卵泡生长发育及以后胚胎质量有重要影响的基因表达，是开展此技 术需要阐明的问题，但目前尚未见相关报道。 迄今已发现的人类印记基因有60多个，其中胰岛素样生长因子．2(IGF．2)和 H19是研究较多的印记基因。这两个基因受同一个D胀调控，很容易受外界环境 的影响。此外，IGF．2蛋白在卵巢局部与性激素、EGF等