人血清脂联素定elisa检测方法的建立及初步临床应用.pdf

摘 要 目的：利用基因工程技术，克隆、表达和纯化具有生物活性的人 脂联素球状结构域(gAPN)重组蛋白，建立一种简便、快捷的检测 讨其与冠心病(CHD)的关系。 方法：1．利用基因克隆技术，构建表达质粒pET22b．gAPN，在 原核表达系统大肠杆菌中重组表达、纯化人gAPN重组蛋白，并通过 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的高血糖小鼠模型血糖改变验证其生物 学活性。2．用抗APN单克隆抗体包被微孔板，10％d、牛血清为封闭 液，另一针对APN不同抗原表位的单克隆抗体生物素化后作为检测 抗体，联合生物素．链霉亲和素信号放大系统，以重组的gAPN蛋白 为标准品绘制标准曲线，建立检测人血清APN浓度的定量ELISA方 平，经冠状动脉造影结果确诊CHD患者共103例，非CHD患者58 例，进一步分析血清APN与CHD发病、冠状动脉病变狭窄严重程度 及CHD危险因子之间的关系。 Western印迹鉴定其具有抗原活性，且该蛋白具有降低高血糖小鼠模 型血糖的生物学活性。2．成功建立了检测人血清APN含量的ELISA 方法。该检测方法的灵敏度为150pg／ml，血清检测准确性、特异性、 线性、重复性好，回收率为91．O％．108．O％。与国内深圳依诺金科技 有限公司的人APN浓度ELISA定量检测试剂盒的相关性良好(r= CHD组f VS 5．67(2．59．10．47)mg／L VS 4．68(3．11．9．05)mg／L，P0．011，而在CHD组中，女性血清APN却低 VS 于男性【4．20(1．83．6．05)mg／L 度加重，APN含量降低，但各组问无统计学差异。血清APN浓度与 与HDL．C水平呈明显正相关(FO．213，P0．01)。 结论：成功克隆了人gAPN基因，并表达出具有生物学活性的人 gAPN重组蛋白；建立了～种简便、快捷、稳定、可靠的人血清APN 水平呈正相关，低APN血症可作为判断CHD发病的一个指标，具有重 要的临床应用前景。 关键词：脂联素，脂联素球形区，克隆表达，酶联免疫吸附测定， 冠心病 Il ABSTRACT OBJECTIVE：To and the clon，express recombinanthuman purify domainof globular adiponectin(gAPN)withbiological activityusing genetic toestablishan engineeringtechnology，then enzyme．1inked immunosorbent for assay(ELISA)method detecting inhuman serumand its in heartdisease． exploreapplication coronary METHODS：1．The was expression