兔结膜上皮干细体外增殖特征的实验研究.pdf

摘要 摘要 目的明确非杯状细胞和杯状细胞在兔结膜组织上的分布情况；探讨 II消化法原代培养兔结膜上皮细胞，观察其体外生长特性；确定兔结膜 Dispase 上皮细胞单克隆培养的条件、单克隆生长特征及不同部位结膜的克隆形成率。 adeno．associatedvirus 研究2型重组腺相关病毒(recombinant 2，rAAV2)载体介 fluorescent 导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green protein，EGFP)对体外 培养结膜上皮细胞的感染和表达情况，为结膜上皮干细胞的定位及rAAV-EGFP 示踪结膜上皮干细胞的体内增殖分化研究提供依据；研究兔结膜上皮细胞单克 隆在裸鼠皮下生长分化情况；检测并分选兔结膜上皮细胞SP细胞群(侧群干细 胞side cells)，为进一步研究SP细胞群和结膜干细胞的关系奠定基础。 population 方法制作兔结膜组织冰冻切片，行Pan．Keratin免疫荧光染色鉴定非杯状 上皮细胞，PAS染色和MUC5AC免疫荧光染色鉴定杯状上皮细胞，观察非杯状 II消化法原代培 上皮细胞和杯状上皮细胞在兔结膜组织上的分布情况。Dispase 养兔结膜上皮细胞，观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态、做免疫荧光及 免疫组化染色鉴定，并比较不同部位结膜上皮细胞PCNA表达情况。rAAV2．EGFP 按感染复数(multiplicity 2代兔结膜上皮细胞，感染后第24h、48h、4d、6d、8d、10d倒置荧光显微镜下 观察细胞中EGFP表达情况，流式细胞仪检测细胞EGFP表达阳性率，MTT方 法检测rAAV2．EGFP转染对细胞增殖的影响。在饲细胞层上分别培养表达EGFP 的兔眼睑结膜、穹隆部及球结膜上皮细胞单克隆，观察单克隆生长特性，比较 疫组化鉴定。利用Hoechst33342染色，流式细胞仪检测并分选兔结膜上皮细胞 SP细胞群。 结果兔结膜的非杯状上皮细胞在睑结膜最厚约6～8层细胞，穹窿部结膜 约3～5层细胞，球结膜较薄约1～3层，非杯状上皮细胞Pan．Keratin表达阳性， 在结膜表明分布较为均匀；杯状上皮细胞MUC5AC表达阳性、PAS染色阳性， II消 且在球结膜、穹窿部结膜和睑结膜，杯状上皮细胞是均匀分布的。Dispase 化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，能传代4-．一5代， 绝大多数细胞Pan．Keratin阳性，少数细胞MUC5AC表达阳性，兔睑结膜、穹 隆部及球结膜上皮细胞PCNA表达阳性率下降，且存在差异。删2一EGFP以 VI 摘要 nm 达，MOI越高，EGFP表达越强，转染效率越高，EGFP表达阳性的细胞在490 波长激发光下发出绿色荧光，弥漫于整个胞浆。随着时间的延长，细胞中EGFP 表达强度增强，EGFP阳性细胞数增加，转染后第7-8天表达达到高峰并维持， 各MOI组转染率比较差异具有显著性，MOI为105组第8天感染效率高达41．2％。 MTT检测各MOI组与对照组差别无显著性意义。兔结膜上皮细胞形成的单克 隆具有多样性，单克隆PCNA染色部分细胞阳性，兔睑结膜上皮细胞具有较高 的克隆形成率，与其它两个部位相比差别具有统计学意义。结膜上皮细胞中检 测到了SP细胞群，并成功分选了SP细胞群，证实了SP细胞群在结膜上皮细 胞中的比例约为2．11％～2．82％。 结论(1)兔结膜的非杯状上皮细胞从睑结膜到球结膜层次依次变薄，杯状 上皮细胞在球结膜、穹窿部结膜和睑结膜是均匀分布的。(2)DispaseII消