尿激酶介导的肿靶向性rhtnf-α原核表达质粒的构建、表达及生物活性研究.pdf

尿激酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-Q原核表达质粒的构建、 表达及生物活性研究 中文摘要 【目的】 1．应用基因工程技术，初步实施hTNF．a靶向改造方案，将本课题组已经构 替换，构建出带有foldon序列，uPA底物序列和hn虾．Q突变体基因的4种的 并实现在大肠杆菌Ros甜ac2(DE3)中的高效表达； 2．初步确立n1TNF．a融合基因表达产物的纯化的最佳方案，获得四种dln师 吨融合蛋白的初步纯化产物。 3．验证尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)对融合蛋白的去封闭效果。 4．去封闭融合蛋白生物学活性的初步研究 ～ 【方法】 1．重组pE，r42a(+)-foldon质粒的构建 序列分析，筛选出序列正确的质粒并命名为重组pET42“+)．foldon。 2．重组pET42a(+)-foldon—uPA-h1’NF质粒的构建 1)用PCR方法扩增得到带有uPA底物序列和hTNF．a突变体基因的融合基因 序列。 2)将扩增的融合基因序列产物克隆连接至pET42a(+)．foldon质粒中，转化， 筛选阳性克隆。 3)对阳性重组子进行DNA序列分析，获得序列正确的带uPA底物序列和 -bTlqF-a、 pET42a(+)-foldon-uPA2-hTNF一0【、 pET42a(+)．foldon-证IA4-hTlm7．0【质粒。 3． 重组pET42a(+)一foldon-u1)A．1-hTNF—a、 杆菌Rosetta2(DE3)中的表达 DNA序列分析。 2)口TG诱导阳性重组细菌表达目的蛋白。 4．表达产物的提取、纯化 GST．Bind P嘶丘cation飚ts方法进行融合蛋白的 1)按Novagell公司BugBuster 提取和纯化。 2)SDS．PAGE分析表达产物和纯化产物。 5． 必对融合蛋白的去封闭效果研究 用uPA分别酶切四种融合蛋白，SDS．PAGE鉴定酶切条带。 6．去封闭融合蛋白生物学活性的初步研究 以生理盐水为阴性对照和hTNF．0【标准品为阳性参照，选取对切除GST标签 删F吨)，利用MTT法检测去封闭融合蛋白1的细胞毒性。 【结果】 粒)，DNA测序结果显示，重组表达载体序列与理论序列完全吻合。 测序结果显示，重组表达载体序列与理论序列完全吻合。 3．初步确立了4种重组表达质粒在大肠杆菌l沁s甜a2(DE3)中的表达条件，并实 现了四种小rNF．0【融合蛋白的高效、可溶性表达，获得4种rh，rNF．a融合基因的 表达产物。 4．确定了融合蛋白的纯化方案，成功切除了融合蛋白上的GST标签。 5．初步验证了uPA对融合蛋白的去封闭效果。 2 6．融合蛋白和去封闭融合蛋白能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。 【结论】 利用基因工程技术对hTNF．n的结构进行了成功改造，初步探索了rhTNF．a 在大肠杆菌Ibsetta2(DE3)高效、可溶性表达的最佳条件以及表达产物的提取纯化 方法。获得切除了GsT载体标签的四种融合蛋白的三聚体化(活性形式)的纯化 产物，验证了尿激酶(uPA)对融合蛋白的去封闭效果，融合蛋白和去封闭融合 蛋白能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。 【关键词】 人肿瘤坏死因子；融合蛋白；重组；克隆；表达；蛋白质纯化；DNA序列 分析；尿激酶型纤溶酶原激活物 constructionand Prokaryoticexpressionplasmid expression， ofof rhTNF—位mediated acti“姆indenti6cationtllmor-targeting by actiVator Urol