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应用RNAi沉默VEGFR．2基因的表达 对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响 中文摘要 【目的】 本研究拟利用RNA干扰技术(IⅢAinterference，RNAi)，以血管内皮细胞生 长因子受体一2(VEGFR．2)的mRNA为靶点，设计、构建VEGFR-2shI斟A的真 路，探讨其对A549细胞增贿及凋亡的影响，从而为非小细胞肺癌(NSCLC)基因 治疗寻找新的靶点。 【方法】 (1)在Genbank查找VEGFR．2cDNA序列(NM002253)，按照RNAi的设计原则， 利用Ambion公司提供的设计软件，筛选出2个VEGFR．2的干扰靶点，同时 设计一个阴性对照，并设计出相应的短发央结构的I斟A模板。 (2)将互补配对的shIⅢA模板分别插入到pGenesil．1质粒中，构建3种重组质粒。 DNA测序验证重组克隆的正确性。 blot分析重组质粒对该基因蛋白质表达的抑制效果，同时筛选出沉默效果最 好的表达质粒。 (4)将筛选出的沉默效果最好的质粒再次转染A549细胞，CCK．8法检测细胞增 殖抑制情况，Hoechst染色检测细胞凋亡形态学变化。 【结果】 (1)测序结果显示：VEGFR．2 shRNA模板成功插入到pGenesil．1表达质粒中， 成功构建shRNA重组表达质粒。 (2)RT．PCR及W色stemblot结果显示：与对照组相比，干扰组shI玳A有效的降解 VEGFR．2mI谢A，由于内源性VEGFR-2mIⅢA减少，VEGFR-2蛋白也相 有效。 (3)CCK．8法结果显示，在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低，细胞增 殖速度减慢，生长受到抑制，转染后72h抑制率最高，与对照组相比，对 细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(尸0．01)。 (4)Hoechst荧光染色显示，转染48h后荧光显微镜下空质粒组的细胞细胞核呈 弥散均匀荧光，且强度较弱，转染了干扰质粒的细胞可见典型的细胞凋亡 形态，细胞核中可见致密的强荧光，荧光增强，胞核缩小碎裂，呈大小不 等的不规则块状细胞碎片。 【结论】 VEGFR．2基因被沉默后，对A549细胞的增殖有明显抑制作用，并促进细胞凋亡。 提示VEGFⅣEGFR．2信号转导通路可作为非小细胞肺癌基因防治的理想靶点。 【关键词】 VEGFR．2；I斟A干扰；重组质粒；A549细胞；细胞增殖；细胞凋亡 4 Inhibitionofthe ofVEGFR一2and expI．ession gene ef佗ctof and onA549RNAi proliferationapoptosisby Abstract 【Objective】 Inthis VectorsofVEGFR一2shRNAwinbe and study，theexpression designed constructed．TheinfluenceofceU onNon—smallcell proliferation，印optosis lung be VEGFR-2 cancer州SCLC)willstudiedbysilencing gene． 【Methods】 VEGFR一2and were (1)Two of ascramblecontrol targetsequences