应用rna干扰术抑制大鼠皮肤成纤维细胞mmp9合成的研究.pdf

应用IⅢA干扰技术抑制大鼠皮肤成纤维细胞hn棚P9合成的研究 中文摘要 应用RNA干扰技术抑制大鼠皮肤成纤维 细胞MMP9合成的研究 专 业：内科学 学位申请人：谢晓英 导 师：严 励教授 摘 要 糖尿病足(diabe血foot，DF)指与下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变 相关的足部感染、溃疡、和(或)深层组织破坏，为糖尿病常见慢性并发症之一。 由于其发病率高，危害性大，治疗费用高，糖尿病足的防治研究是当今糖尿病领域 的热点之一。目前对其发病机制的研究除了血管病变、神经病变以及感染等因素之 外，对糖尿病足特征性的慢性难愈性伤口的分子机制的研究也日渐增多。在众多分 子机制中，基质金属蛋白酶(MMPs)与糖尿病足关系的研究较为完善和深入。 基质金属蛋白酶家族是一组Zn“依赖性肽链内切酶，它们能够降解细胞外基质 和非基质蛋白。MMP9(92kD)也称明胶酶B，含特有的Ⅳ型胶原样功能域，可降解 多种胶原蛋白、弹力蛋白等皮肤基质成分。众多研究发现，在糖尿病完整皮肤组织 中MMP9表达量已显著增高；溃疡发生后，伤口组织及伤口渗液中MMP9的含量 增高，活性增强；在糖尿病足愈合的过程中，MMP9的升高不仅降解细胞外基质， 还加速生长因子、生长因子受体、整合素及其受体的降解，从而加重局部伤口炎症 反应，并减慢伤口的愈合。 已证实糖尿病足部组织以及伤口渗液中MMP9表达量增高是造成糖尿病皮肤 易损性增加以及伤口难愈的重要因素之一，但MMP9的增多具体由哪些细胞分泌增 多所造成，则尚存争议。目前多认为糖尿病伤口中MMP9主要由中性粒细胞、角质 形成细胞和单核巨噬细胞等产生，成纤维细胞(丘bmblast，FBs)尚无明确定论。作 为皮肤真皮层的主要细胞，成纤维细胞参与了创伤愈合全过程，其数量和功能都直 接影响伤口的愈合情况，为主要的修复细胞。有研究表明正常皮肤成纤维细胞极少 应用RNA干扰技术抑制大鼠皮肤成纤维细胞MMP9合成的研究 中文摘要 或无MMP9蛋白的表达，而糖尿病伤口来源的成纤维细胞MMP9表达量增高。体 外模拟糖尿病伤口环境，例如采用高糖、炎症因子、同型半胱氨酸等培养正常皮肤 成纤维细胞，亦可增高其MMP9表达量，提示在糖尿病环境下成纤维细胞除作为伤 口的主要的修复细胞外，可能也参与了MMP9的表达及失衡，进而影响伤口愈合。 综上所述，抑制局部伤口的MMP9的表达可能是加快糖尿病足伤口愈合的方 法之一，然而目前尚无MMP9的特异性抑制剂。 对呵A干扰(RNAilltem糙nce，RNA)是在生物体内抑制特定基因表达的一种现 stmnded 象，它是指将与内源性rI瓜NA编码区同源的双链RN舡(doubleRNAs， dsRN心)导入细胞，可高效、特异地使n浓NA发生降解而导致基因表达沉默。由于 其高效、特异的抑制效果被广泛应用于基础研究。本研究应用RNA干扰技术抑制 大鼠皮肤成纤维细胞MMP9合成，探讨其能否作为抑制糖尿病皮肤成纤维细胞中增 高MMP9的方法，为后续对MMP9基因沉默对糖尿病足治疗(敷料等)的研究打 下基础。 研究目的 1定位正常大鼠、糖尿病大鼠以及糖尿病大鼠伤口周围皮肤MMP9分布，并比 较各组间MMP9表达量的差异；确认成纤维细胞是否参与糖尿病皮肤及其伤口中 MMP9的表达增高及失衡。 2阳离子脂质体转染siRNA抑制成纤维细胞MMP9基因的表达，筛选出抑制 效率最佳siRNA片段。 材料与方法 1．免疫组化定位MMP9分布 实验分3组：正常SD成年大鼠背部皮肤、STZ法成模的SD糖尿病大鼠(6周) 背部皮肤、STZ大鼠背部伤口形成后3天伤口周围皮肤组织，免疫组化对MMP9表 达在真、表皮中进行定位，并比较三组表达量的差异。免疫组化(S—P法)操作步 骤按说明书进行，切片常规脱蜡水化后，加入过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化