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感觉神经肽受体抗剂对哮喘大鼠气道平滑肌细胞作用的基础研究
·中文论著摘要·
感觉神经肽受体拮抗剂对哮喘大鼠气道平滑肌细胞作
用的基础研究
刖 罱
哮喘是由于气道暴露于各种抗原及化学刺激物所引起的慢性炎症。慢性气道
炎症及气道高反应性是哮喘的主要特征。目前对于哮喘的治疗大多集中于抑制哮
喘气道炎症及减轻气道高反应性。糖皮质激素对于哮喘治疗是一线类药物,但是
其不能完全控制哮喘,因此,对于哮喘发病机制的研究有利于探讨哮喘治疗的新
途径。目前对于哮喘发病机制的研究大多集中于免疫机制、气道平滑肌及气道上
皮功能的研究。近几年感觉神经肽及其受体与哮喘关系的研究日益被引起关注。
P,SP)、神经
目前认为与哮喘关系较为密切的感觉神经肽有P物质(Substance
激肽A(NeurokininA,NKA)、神经激肽B(NeurokininB,Nl①),通过相应的
研究证实哮喘患儿血浆及哮喘豚鼠血浆、气管灌洗液、气道组织中sP含量均显
著增加,哮喘豚鼠气道组织中SPmRNA表达较正常豚鼠明显上调,均与病情呈
正相关。但是对于感觉神经肽受体在哮喘气道的表达及其受体拮抗剂对哮喘气道
作用的研究甚少。因此,本文通过制作哮喘大鼠模型以探讨感觉神经肽受体
NK-IR在哮喘气道的表达及其受体拮抗剂对哮喘气道的影响,为哮喘的治疗提供
新的理论依据。
气道平滑肌细胞在哮喘气道是一种重要的效应细胞,其受气道内各种因素,
尤其是各类免疫细胞所释放的细胞因子和炎性介质的调节,产生相应的收缩反应,
调节气道的口径,从而影响呼吸功能。在持续哮喘的病例中,ASMC在细胞外基
质、各种细胞因子、炎症因子和生长因子的作用下,ASMC会出现迁移性生长的
现象。因此,气道平滑肌细胞对于哮喘的发生、发展及预后起到重要的作用。感
觉神经肽P物质有刺激气道平滑肌细胞增殖、迁移的作用。但是对于P物质受体
拮抗剂对气道平滑肌细胞增殖、迁移作用的研究甚少,因此,本试验通过对哮喘
大鼠研究以探讨感觉神经肽P物质及其受体在气道平滑肌细胞表达分布的基础
上,通过P物质受体拮抗剂干预原代培养大鼠气道平滑肌细胞,以说明P物质受
体拮抗剂对气道平滑肌细胞增殖、迁移的影响。
气道平滑肌细胞的生物活性是通过细胞内钙离子浓度的改变来完成的。气道
平滑肌细胞内钙离子浓度的改变与哮喘慢性气道炎症及气道高反应性密切相关。
完成的。哮喘气道平滑肌细胞SERCA2表达减少与细胞内钙离子浓度增高有关。
酰肌醇二磷酸(PIP2)第二信使系统相联系,并通过三磷酸肌醇(IP3)作用于膜
上的钙离子通道,引起膜电位的去极化和蛋白激酶活性的改变,从而发挥其生物
功能。目前,对于感觉神经肽受体拮抗剂对于哮喘气道平滑肌细胞内钙浓度及肌
浆网钙.ATP酶影响的研究甚少,因此,本实验通过荧光检测细胞内钙浓度成像系
统及real.time
剂对气道平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。
材料与方法
1、大鼠哮喘模型的制作:
按照Wistar大鼠哮喘模型制作哮喘模型,即第一天及第七天腹腔注射1%卵
始雾化吸入1%卵蛋白诱喘7天。将45只Wistar大鼠随机分成正常对照组、哮喘
组、普米克令舒治疗组。用卵蛋白雾化吸入制作哮喘大鼠模型。普米克令舒治疗
组吸入卵蛋白诱喘后给予普米克令舒吸入治疗。
2、标本采集:
造模第2l天取材,每组大鼠于末次激发24h内腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,
进行左肺肺泡灌洗。右肺中叶置于4%多聚甲醛用于HE和免疫组化染色。剩余气
管及肺组织.80℃冰箱保存用于抽提总RNA、抽提蛋白。
3、支气管及肺组织病理学检测:免疫组化图像分析检测NK-1R表达组间差
2
异。
4、大鼠气道平滑肌细胞原代培养:用酶消化法原代培养,差速贴壁法纯化
ASMC,第4代的ASMC用于实验。
5、Real.time
PCR检测体外培养纯化的第4代细胞NK.1RmRNA表达差异。
6、免疫细胞化学检测气道平滑肌细胞NK.1R表达。
7、 四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT)检测NK-1R拮抗剂对IL.13诱导气道平滑
肌细胞增殖的影响;流式细胞仪检测ASMC细胞周期变化。
8、Transwell小室检测NK
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