成年哺乳动物视膜神经细胞再生的相关研究.pdf

中文摘要 成年哺乳动物视网膜神经细胞再生的相关研究 摘要 青光眼、视神经外伤、视网膜色素变性等疾病是眼科临床中高发的不可逆 致盲性眼病，极大地危害了患者的身心健康。由于在成年哺乳动物中，损伤的视 网膜神经细胞无法再生，故治疗效果差，治疗手段有限，是临床上的一大难题。 本研究从两方面着手：一是神经轴突受损而神经元胞体还存活的病理状况，我们 致力于通过研发组织工程神经导管促进成年哺乳动物体内的视神经轴突再生来 修复：另一方面是神经细胞也损伤失活、残存的神经细胞不足以维持正常神经功 能的病理状况，我们将成年哺乳动物体内的内源性因子ephrinA3作为靶点，研 究其对视网膜干细胞增殖和分化的调节作用，从而为治疗各种累及视网膜神经细 胞的疾病打下基础。 第一部分：一种新的组织工程化导管移植促进成年大鼠视神经再生的实验研究 目的：通过研发一种新的可降解的组织工程化导管，移植在损伤的视神经断 端促进成年大鼠的视神经轴突生长，从而探索外源性微环境改变对促进视神经再 生的作用。 方法：(1)制备转基因雪旺细胞：构建GFP．CNTF真核细胞表达质粒，用电 穿孔法将其转染培养的雪旺细胞，在转染后3小时一7天在荧光显微镜下观察绿 色荧光的表达时间和转染效率。在细胞转染CNTF后24小时，用RT-PCR检测 证实基因的转染效果。(2)制备组织工程化导管：用PGA细丝填充于中空的PLGt牝 导管中，然后分别将转染CNTF的雪旺细胞或单纯雪旺细胞填充入导管，并过夜 培养，使细胞更好地贴附。(3)动物实验：用成年SD大鼠，分成3组，每组6 —8只，分别为：①转基因雪旺细胞导管组、②雪旺细胞导管组、③空导管组。 首先手术造成大鼠视神经横断伤，然后将各种导管缝合至大鼠视神经近侧断端々 (4)评价再生效果：导管移植4周后，用再生轴突标记物GAP．43抗体标染备 组导管的冰冻切片，每张切片从视神经断端开始，每625微米作为一个计数点』 每只大鼠取5张切片进行计数并取得每个距离计数点再生轴突的平均数，然后对 每个距离计数点的再生轴突数量在三令实验组之间用OneWayAnova进行统计 分析。同时，用透射电镜观察导管内部雪旺细胞的存活和再生轴突的微细结构I 中文摘要 (5)观察导管炎症及降解情况：用臣噬细胞和小胶质细胞标记物OX42抗体标 染导管冰冻切片以观察导管内炎症反应的情况，并在移植磊4周和2个月观察导 管材料的降解情况。 结果：(1)成功制备转基因雪旺细胞：测序证明GFP．CNTF质粒构建成功， 将质粒转染雪旺细胞后3小时绿色荧光开始表达，24小时达到高峰，可持续一 周。将质粒转染雪旺细胞24小时后，RT-PCR结果可见转染CNTF的雪旺细胞 有较高的CNTFmRNA表达，免疫组化结果显示转染CNTF的雪旺细胞表达 CNTF,从悉证实了该基因转染方式的有效性。(2)GAP43免疫组化计数再生神 经纤维：将三种导管移植在成年大鼠视神经横断伤末端4周后，用GAP43标染 组织工程化导管内的再生神经纤维。在距离视乳头18751am的导管内部，单纯 (5a：2．06／ram／section，P0．05，oneanova，n=6或8)．说明该组织工程化 way 导管填充雪旺细胞后具有明显的促进视神经再生的作用。在离视神经断端约 5000pm的导管内部，转基因雪旺细胞导管组的再生轴突数量为 在离视神经约5625pm的导管内部，转基因雪旺细胞导管组的再生轴突数量为 说明移植转染CNTF的雪旺细胞填充的神经导管组的褥生效果比移植单纯雪旺 细胞填充的神经导管组好。 (3)电镜观察再生轴突：导管移植4周后，电镜观 察见导管内转基因的雪旺细胞导管内仍可见存活的雪旺细胞，并且可见再生神 经纤维，从而进一步证实了轴突的再生。(4)导管内部炎症情况和导管降解情况 的观察：臣噬细胞和小胶质细胞标记物OX42对导管冰冻切片的免疫组化染色显 示移植4周后，导管内没有严重的炎症反应。导管在体内移植后2个月后降解。 结论：我们成功研制了一种新的可降解的组织工程化神经导管，可以有效地 促进成年大鼠的视神经再生．该导管的研发为将来治疗各种神经轴突损伤性疾 病打下一定研究基础。 第二部分：