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成纤维细胞活化蛋白FAP 对小鼠胰腺癌细胞的影响及治疗研究 中文摘要 目的：构建小鼠成纤维细胞活化蛋白FAP的真核表达质粒，通过转染体外真核 细胞系及免疫注射C57BU6小鼠，综合评价该真核表达质粒在体外及体内表达 的工作效率，并验证该重组表达载体作为核酸疫苗对于肿瘤相关成纤维细胞的杀 伤效果以及对荷瘤小鼠胰腺癌肿瘤细胞增殖的抑制效应，从而为胰腺癌的预防和 治疗提供一个新的手段和思路。 方法：根据GenBank中小鼠FAP基因(NM007986)全序列设计PCR引物， 利用多聚酶链式反应获得其开放式阅读框(ORF)。将目的基因片段克隆至真核 表达载体pcDNA6，my争His．B，转化感受态大肠杆菌并筛选重组子。将重组质粒 转染体外培养的HEK293细胞系，利用免疫荧光染色法(IF)及蛋白质免疫印 迹(Westem BIotting)检测外源性FAP蛋白是否能够在细胞中顺利表达。之后， 通过分离并培养原代小鼠胰腺癌细胞及肿瘤相关成纤维细胞，利用小干扰分子 (RTQ—PCR)、W色stem Blotljng实验及免疫荧光(IF)实验来检测其靶向沉默 的效果；同时利用噻唑蓝染色法(MTT)和流式细胞术(FCM)来检测当内源 性FAP蛋白表达下调后，“原代胰腺癌一肿瘤相关成纤维细胞”共培养体系中， 两种细胞的增殖和凋亡情况，明确FAP对于胰腺癌细胞及胰腺癌相关成纤维细 胞增殖和生长的抑制作用。利用FAP真核表达质粒免疫C57BU6小鼠，通过免 疫组织化学(1CH)及RTQ．PCR方法检测其在小鼠体内的表达情况。最后，将 小鼠胰腺癌细胞接种于小鼠皮下，分组：FAP免疫组、空白质粒免疫组和生理 盐水对照组。而后监测瘤体体积、小鼠生命周期及瘤体组织中波形蛋白Ⅵmentin (成纤维细胞标志)、角蛋白CK8(上皮细胞标志)及FAP的表达，来衡量FAP 作为核酸疫苗是否可以预防和控制胰腺癌肿瘤细胞的增殖和生长，延长荷瘤小鼠 的生存周期。 结果：对于小鼠FAP的真核载体，经过酶切鉴定、测序比对，确定所筛选的阳 生相应蛋白质产物。免疫荧光染色结果也表明，在转染pcDNA6．mFAP重组子 转染组的细胞均无上述荧光表达。另外，WbStem BIotting结果也显示，转染 其他两组细胞均无此条带产生，故所有实验结果均表明，所构建的 pcDNA6．mFAP重组子可以在体外培养的真核细胞中顺利表达外源性FAP蛋白。 随后，本实验成功分离小鼠原代胰腺癌细胞和肿瘤相关成纤维细胞，并且建立了 两者共培养体系模型。HE染色可见共培养体系模型中的胰腺癌细胞及肿瘤成纤 的共培养体系模型(0．99±0．07，，，=3，P0．05，ftest)及未转染任何分子的空 的统计学差异。同样Wbstem 共培养体系模型中，FAP蛋白的表达量(27．18％±3．23％)远远低于转染 test)及未 test)，该结果具有显著的统计学差异。实验结果表明，所设计的sjRNA可以成 胰腺癌细胞的生长速率远远小于空白对照组和转染siRNA—MOCK的细胞组；而 胰腺癌细胞的增殖抑制率从转染后第二天起即明显高于另外两组数据，差异具有 显著统计学意义(P0．01)，且该增殖抑制率随时间的增长呈现负增长趋势， 至第七天达峰值。另外，FCM结果也表明，转染了siRNA．FAP的细胞出现了明 非常显著的统计学差异(P0．01)。上述实验结果表明，FAP蛋白的表达下调 2 会显著抑制小鼠胰腺癌细胞及肿瘤成纤维细胞的增殖和生长，并引起细胞的凋 果都提示，注射了FAP真核表达质粒的小鼠，其组织中均有FAP的高表达，而 空白质粒组和生理盐水组中未见相应蛋白表达。同时，通过对不同分组小鼠注射 相应质粒后进行肿瘤细胞接种，进行免疫组化测定并计算其生存周期和瘤体体积 测量。免疫组化结果显示：经FAP真核质粒免疫后的小鼠，其肿瘤相关成纤维 细胞表面FAP蛋白的表达明显减弱，与生理盐水对照组相比，具有显著的统计 学差异。同时，肿瘤上皮细胞标志CK8和成纤维细胞标志、，emetjn的表达，也 明显低于生理盐水对照组，具有非常显著