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新型乙型肝炎病载体的构建及初步应用研究
中文摘要
新型乙型肝炎病毒载体的构建与初步应用研究
摘 要
乙型肝炎病毒(HBV)载体是近几年新发展的一种病毒载体,不
仅具有天然嗜肝特异性,而且具备改造为肝靶向性基因治疗载体的基
本条件。主要包括:在肝细胞内持续复制、反复感染,病毒本身对细
胞没有明显的细胞毒性;能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒;能
够介导外源基因的转移和表达;但由于基因结构复杂,目前改造的
HBV载体均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点,而
且HBV载体制备困难,感染效率低,为解决目前存在的困难,有必
要使其与其他病毒载体联合应用。如与腺病毒载体、慢病毒载体、杆
状病毒载体或逆转录病毒载体联合应用,实现高载容量、高转染效率、
高复制能力,充分发挥HBV载体嗜肝导向性,可以利用体内野生型
HBV为之提供包装,在体内形成具有抗HBV作用的HBV样颗粒,
或携带治疗性目的基因,进一步感染其他肝细胞,实现放大效应。因
此,通过病毒载体之间的重组,拓宽了HBV载体应用领域,不仅有
望用于抗HBV基因治疗,也可以用于制备DNA疫苗、筛选抗病毒
药物或通过携带外源性标志基因用于HBV分子生物学研究等。本研
究通过构建新型的HBV’载体表达不同的目的基因,构建了持续分泌
选HBV易感细胞系;或与腺病毒载体联合构建了表达MMP8等目的
基因的质粒,用于抗肝硬化的基因治疗,为HBV的分子生物学研究
和肝硬化的生物治疗等开辟了新途径。本研究共分3部分完成。
第一部分新型tlBV载体的构建
目的应用分子生物学技术改造HBV载体,阻断其结构基因的表
达,提高HBV载体作为基因治疗载体的安全性,使其更适用于作为
基因治疗载体。
方法:
1
中文摘要
and
pre.S2、SX等结构蛋白的表达,构建pCH.M5.GFP质粒。
2
和pCH.M5.hRLuc两个质粒。
3外源基因的表达能力的检测HBV载体经基因改造后,通过质
粒共转染肝细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,应用荧
-光素酶检测试剂盒检测海肾荧光素酶的表达水平,鉴定新构建质粒
力。
4重组HBV复制能力的检测。与辅助质粒共转染后,提取细胞裂
解液中的HBVDNA,Sorthemblot技术检测重组HBV复制能力。
5重组HBV感染树购肝细胞能力的检测。原代培养树嗣肝细胞,
感染浓缩的重组HBV颗粒1W后,观察细胞内GFP的表达水平。
结果:
l成功构建了不能表达HBV结构基因的新型HBV载体。
2新型HBV载体外源基因的表达水平基因突变后表达GFP的
质粒转染肝癌细胞系后,GFP表达水平明显强于原始质粒。
3通过southem
blot检测在细胞裂解液中能够形成HBV复制中
间体。
4重组HBV感染树驹肝细胞lW后,能够观察到GFP。
结论:‘HBV载体通过变更起始密码子和终止密码子后,阻断结
构基因表达,在S基因区插入报告基因GFP和hrLUC,构建了新质
粒,其外源基因的表达水平高于对照原始载体质粒,能够形成HBV
DNA复制中间体,而且形成的重组HBV能够感染树驹肝细胞。
细胞系的构建
目的:
构建一个持续分泌重组HBV的细胞系,该重组HBV表达杀稻
瘟菌素抗性基因(BsdR)。
方法:
1构建具有G418抗性的无包装信号的HBV辅助质粒
中文摘要
pcDNA3.1.CH3142与表达BsdR的HBV载体质粒。
选,获得阳性细胞克隆。
的细胞系。
4 Western
G418反复加压培养,Southernblot和Nativeblot技术,
再次筛选,获得高表达Bsd的重组HBV的细胞系,并通过PCR技术
检测重组HBV的表达水平。
所构建细胞系无野生型HBV形成。
6应用免疫电镜技术观察到完整的有囊膜包被的重组HBV颗
粒。
结果:
1转染后,经G418筛选后,获得50余个细胞克隆。
2挑选其中36个进行扩增,经同位素标记探针斑点杂交法检测
细胞上
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