新发现的人类bca病毒与儿科呼吸道感染相关性的初步研究.pdf

中文摘要 新发现的人类Boca病毒与儿科呼吸道感染相关性的初步研究 博士研究生：赵林清 指导教师：钱渊 2005年9月，瑞典科学家Allmder等人报道在人类呼吸道标本中检测到一种细 小病毒样核苷酸序列，所推导的氨基酸序列与牛细小病毒及犬微小病毒同源性较 高，而与人细小病毒B19也有同源性，但是很低。由于细小病毒B19自70年代被 分离、80年代被确定为病原体后，一直被认为是已知的唯一对人类致病的细小病毒， 说明这一新发现的病毒是一种新的对人类致病的细小病毒。现在暂时将这一新发现 能主要感染儿童，临床上主要引起下呼吸道感染。随后澳大利亚、加拿大、日本、 美国、中国等相继报道在呼吸道感染患者的呼吸道标本中检测到该病毒基因。近期 又有多篇文献报道在呼吸道感染患者的血液标本及胃肠炎患者的粪便标本中检测 到HBoV。虽然目前的临床研究及实验室研究进一步更多的提示HBoV可能是呼吸 道的、胃肠道、甚至全身性的感染或疾病的病因，但HBoV的致病性尚无定论，HBoV 究竟是病原还是过客?是否存在与腺病毒相关性细小病毒的无症状感染相似的无 症状呼吸道感染?作为一种新近报道的病毒，HBoV是久已存在刚被发现，还是确 实是一种新出现的病毒?它在人群中的流行情况如何?北京地区儿童的呼吸道感 染是否与这种病毒有关?这一系列问题的回答只有依靠更多的研究、更多的资料积 累。 为了了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与HBoV的关系，选择了这一研究课 题。最初选择2003年11月至2004年lO月收集的经间接免疫荧光和／或病毒分离 进行了常见呼吸道病毒检测的急性呼吸道感染患儿标本728例，应用针对HBoV的 5例，对其PCR扩增产物直接进行核苷酸序列测定。将所测到的序列与GcnBank中 的基因序列进行比较分析，以确证所用方法的可靠性。所检测的728例标本中有17 例有预期大小的基因片段扩增，提示为HBoV阳性，其阳性检出率占本组检测标本 的2．3％，其中一例合并有腺病毒的感染；基因序列分析表明选取的HBoV基因检测 阳性；HBoV阳性检出率在本组的毛细支气管炎患儿中最高，达7．3％(6／82)，其 次为支气管炎(3／69，4．2％)的患儿；HBoV检测阳性标本的患几年龄主要分布于 例患儿中以及5岁的69例患儿中均未检测到HBoV阳性标本。这一结果提示北京 地区部分儿科患者的急性呼吸道感染与HBoV有关，且HBoV感染在小年龄组儿童 中更为常见。 为了了解北京地区人Boca病毒(humanbocavirus，HBoV)的基因组编码特征， 并对其基因组编码的非结构蛋白NSl、核蛋白NP．1以及病毒外壳蛋白VPl及VP2 的二级结构等特性进行预测分析，从已确证为HBoV阳性的两份临床标本BJ3064、 片段，PCR产物直接测序后得到基因组序列，将其上传至GenBank,运用生物信息 学的方法，对HBoV 及其它生物学特性进行了预测分析。结果显示HBoVBJ3064及BJ3722基因组序列 全长分别为5299 domain bp、5300bp，共有四个主要的CDS(codingsequences)，分 构如Gt螺旋、B片层，p转角在不同蛋白中占有不同比例；各蛋白均无明显的跨膜 结构域；NSl、NP．1属不稳定蛋白，VPl、VP2属稳定蛋白。这一结果提示北京地 区BJ3064、BJ3722基因组序列与瑞典科学家报道的原型株之间有很高的同源性； 而对蛋白二级结构等生物信息学分析必将有益于蛋白的表达、分离纯化以及蛋白检 测条件的选择。 目前为止，仅有少量的关于健康人群及急性呼吸道感染的婴儿体内HBoV特异 性获得性免疫的报道，主要原因在于缺乏可分离到的病毒或病毒抗原以及标准的诊 断方法。本研究分别利用原核表达系统及真核表达系统进行了HBoVVP2蛋白的表 4 达。在利用原核表达系统的研究中，首先从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722 VP2蛋白编码区基因片段，将其克隆至 中经聚合酶链反应(PCR)扩增得到HBoV 列测定等方法挑选、鉴定阳性克隆，得到重组表达质粒pET30b．VP2，转化大肠杆 菌BL21(DE3)，在不同的温度下利用IP