第七章 生药资源的开发利用精要.ppt

从海洋生物中开发  我国仅植物资源就异常丰富, 经查明的高等植物就有3 万余种, 而实际上我们目前开发出来作为中药材的仅占其中的1/5 不到, 植物化学成分和药用价值方面的研究仅仅涉及极少的种类。 近20 年来随着陆地资源的减少、人口的增加和科技水平的提高,　人类面临着可持续发展与资源和环境的矛盾,　以开发海洋资源为标志的“ 蓝色革命”正在形成前所未有的浪潮,　发达国家对海洋资源的争夺也日益白热化。生命起源于海洋,　占地球表面积71. 8 % 的浩瀚海洋将成为21 世纪全球关注的新焦点,　因此,　在某种程度上讲21 世纪将是“海洋的世纪”。　海洋特殊生态环境中的生物资源已成为拓展天然药用资源的新空间。 植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23-27 ℃之间进行，一般采用25土2℃。 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： ★一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。一般光照强度为1000~5000 lx ★光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 ★光质，对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 1.目的基因的分离 （1）已知基因的获得 ①化学合成法 ②PCR扩增 （2）未知基因的获得 ①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 3.受体材料的准备 4.遗传转化 （1）间接转化法——农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法 表1 几种植物转基因方法比较 5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法 6.炼苗 ① ② pGEM-T ③ ④ ⑤ ⑥ ⑥ ⑦ ⑧ ①银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA ③chs全长cDNA的克隆 ④TA克隆及测序 ⑤向chs两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌 2.植物表达载体的构建 根癌农杆菌 是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。 基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。 电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力. 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化. PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体. 转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法） 无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单 DNA直接转化法 （1）基因枪转化法 （2） 电击法 （3） PEG介导基因转化法 （4）花粉管通道法 转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。 转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞 受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高； DNA间接转化法 农杆菌介导基因转移 转化的缺点 转化的优点 转基因方法 带有转化基因的农杆菌活化 受体植物 叶盘 侵染 共培养 筛选培养 诱导成苗 预培养叶盘，或愈伤组织 四、生物转化技术 生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代化石资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等，是解决人