第七章DNA体外重组与基因转移精要.ppt

一、 DNA的体外重组（切与接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 第八章 重组转化子的筛选和鉴定（检） 某一细菌质粒载体的Tetr基因中含有一个HindⅢ切点，用HindⅢ切割果蝇的基因组DNA，并以该载体构建基因文库，分子杂交证明阳性克隆带有果蝇的目的基因，用HindⅢ和EcoRV对质粒和阳性克隆(克隆15)进行酶切分析，电泳结果如图1，试绘出含有插入片段和不含插入片段的质粒限制性酶切图谱，并标明Tetr的位置。 检测克隆DNA序列的其它方法： 菌落或噬菌斑原位杂交法 DNA序列分析法 蛋白质生物功能测定法 第九章 外源基因的表达 考试题型 一、名词解释（ 3’ × 5 ） 二、判断（1’×10） 三、填空题（ 1’× 10） 四、问答（ 10’× 5） 五、分析和计算（15 ’× 1;10’×1） 酵母双杂交结果 外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 DNA结合蛋白编码基因的鉴定： 影印 用聚乙烯薄膜影印裂解平板 洗涤 杂交 感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 聚乙烯膜 探针选用能与 目标蛋白特异 性结合的DNA 片段 外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法 杂交释放转译鉴定： 合并 变性 挂柱 制备 上样 淋洗 洗 脱 翻 译 测 活 重组DNA 单链DNA mRNA 杂交的mDNA 蛋白质 蛋白质 无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物 外源基因产物检测 蛋白质生物功能鉴定法 放射免疫原位杂交鉴定： 影印 用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印 洗涤 与I125标记的IgG保温 感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 与I125标记的IgG保温 洗涤、干燥、感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板 外源基因产物检测 蛋白质生物功能鉴定法 免疫沉淀鉴定： 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液 37℃ 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标 蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀 反应，在菌落周围形成白色的圆斑 此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大 ?一. 当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素： 1. 外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体） 2. 对转录产物能否进行加工修饰（利用cDNA） 3. 转录产物的稳定性 4. 转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术） 5. 密码子的使用频率（选用适当宿主细胞） 6. 翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞 7. 翻译产物的稳定性 8. 外源基因产物对宿主是否有害 9. 外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体） 10. 外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞） 11. 外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体） 12. 对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法 二.?表达系统 1.??大肠杆菌系统: 融合表达和直接表达 小于80AAs的多肽可用融合表达系统, 分子量在100-300AAs 且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达 pET(plasmid for expression by T7 RNA polymerase), pTrcHis系列载体 2.??酵母表达系统: 酿酒酵母和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)系统 直接表达和分泌表达 3.??昆虫杆状病毒表达系统 直接表达和分泌表达 4.?哺乳动物细胞表达系统 瞬时表达和稳定表达: 非微生物来源的大于500AAs的分泌蛋白质和表面受体蛋白 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子 一、载体遗传标记检测 1.抗药性筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗药性筛选法的基